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PCR擴增出現非特異性條帶情況解讀

2025-3-31  閱讀(140)

實驗方法原理:

①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應做準備;

②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;

③引物的延伸:DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

重復循環變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈",而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘, 2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

典型的PCR包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個步驟,通過將這一套過程不斷循環,使DNA得以成百萬倍的擴增。

PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現,其原因:

一是引物與靶序列不全互補、或引物聚合形成二聚體。

二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量,往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現,酶量過多有時也會出現非特異性擴增。

其對策有:

①必要時重新設計引物。

②減低酶量或調換另一來源的酶。

③降低引物量,適當增加模板量,減少循環次數。

④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。

出現片狀拖帶或涂抹帶:

PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多引起。

其對策有:

①減少酶量,或調換另一來源的酶。

②減少dNTP的濃度。

③適當降低Mg2+濃度。

④增加模板量,減少循環次數。




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