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建立間接的ELISA方法適合己烯雌酚樣本快速檢測
己烯雌酚（diethylstibestrol, DES）是一種人工合成的雌激素,在促進動物蛋白質的合成代謝、提高動物日增重和減少脂肪等方面效果明顯,因此一直被作為一種動物生長促進劑用于畜禽以及水產品養(yǎng)殖中。癌癥研究機構（IARC）研究發(fā)現(xiàn),DES是一種致癌物質,能夠在動物源性食品如肝臟、肌肉、蛋、奶中殘留,并通過食物鏈危害人體健康。因此世界各國規(guī)定食品動物養(yǎng)殖中不得以任何途徑和方式使用DES,養(yǎng)殖動物及動物性食品中不得檢出DES。 本論文針對DES的結構特點,設計并合成了DES半抗原和人工抗原,并對DES半抗原和人工抗原進行了表征和鑒定,制備出了己烯雌酚的高質量的多克隆抗體,應用間接ELISA方法和Western Blot測定了抗體的特異性,建立了己烯雌酚的酶聯(lián)免疫檢測方法以及相應的樣品提取方法,并且用HPLC方法對ELISA檢測方法的精密度和準確度進行了驗證。 本文分兩部分,*部分對己烯雌酚進行了結構修飾,用有機合成方法合成了己烯雌酚-單-羧基丙基-醚（DES-MCPE）和己烯雌酚半琥珀酸（DES-HS）,并通過紅外、質譜和核磁共振對合成產物進行了鑒定之后分別將己烯雌酚衍生產物利用優(yōu)化的混合酸酐法、碳二亞胺法與牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）偶聯(lián),分別作為免疫抗原及包被抗原,并且通過紫外掃描光譜、SDS-PAGE電泳試驗驗證偶聯(lián)效果。 第二部分,以合成的DES-HS-BSA, DES-MCPE-BSA免疫新西蘭大白兔得到抗血清,優(yōu)化抗體純化條件,得到DES抗體,應用Western Blot和間接ELISA法驗證了抗體的特異性；探討了間接ELISA測定DES抗體的條件；并對DES抗體與游離DES的特異性結合反應進行測定。采用碳二亞胺法連接的DES-HS-BSA作為免疫原得到的抗體進行間接競爭ELISA實驗,優(yōu)化了ELISA工作條件,建立了間接競爭ELISA檢測DES方法。方陣滴定法確定*OVA-HS-HSA包被抗原的濃度為2.5μg/mLDES-HS-BSA,酶標二抗（羊抗兔IgG-HRP）工作濃度為1：7500以及抗體的工作濃度為1：6400。以上述試驗條件為基礎,以系列稀釋的DES標準溶液作為檢測對象,繪制標準曲線,得到的線性回歸直線方程為y=-2.6679x+3.0589,相關系數(shù)R2=0.9969,從標準曲線可以得知,此方法可測定的zui適范圍為Ong/mL～100ng/mL,zui小檢測限約為8.4ng/mL。本實驗所建立的ELISA方法的度以批內誤差表示,結果表明孔間差異2.57%（n=5）,度較好。在可測定濃度范圍內己烯雌酚（DES）抗體與其他二苯乙烯類激素免疫交叉反應較小,在添加回收實驗中,對豬肉樣本在10ng/mL,50ng/mL,100ng/mL三個濃度的平均回收率為109.41%。實驗結果表明所建立的間接ELISA方法有較高特異性和選擇性,適合己烯雌酚藥物殘留樣本快速檢測。
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