豬白細胞介素-8（IL-8）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究研究使用                                    

預期應用

ELISA法定量測定豬血清、血漿、細胞培養物上清、肺泡盥洗液等其它相關液體中IL-8含量。

概述

白細胞介素（IL-8）是1987年首先在受脂多糖刺激的豬單核細胞培養液上清中分離提純的一種堿基肝素結合蛋白，具有內源性白細胞趨化和活化作用，zui初命名為單核細胞源性中性細胞趨化因子（monocyte-drvived neutrophils chemotactic factor, MDNCF），1998年被正式統一命名為中性粒細胞活化肽/IL-8（NAP/IL-8）。IL-8屬于CXC型亞家族，又因其氨基酸*個半*前有*-*-*而稱為ELR⁺-CXC型趨化因子。IL-8是一種可由多細胞來源的多功能趨化因子，其生物學功能無種屬特異性，除具有特異性使中性粒細胞離開血流游走到炎癥組織，脫顆粒，產生超氧陰離子，引起呼吸爆發外，還顯示出促血管生成的活性，可參與多種惡性腫瘤的轉移及血管生成。此外，IL-8對淋巴細胞和其它免疫細胞也有趨化和活化作用。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中IL-8水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入IL-8抗原、*化的抗豬IL-8抗體、HRP標記的親和素，經過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-8呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成

1.         酶聯板：一塊（96孔）

2.         標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，充分混和后其濃度為1000pg/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成500 pg/mL，250 pg/mL ，125 pg/mL，62.5pg/mL，31.2pg/mL，15.6 pg/mL，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內配制。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A1：100稀釋。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標本的采集及保存

1．細胞培養物上清：請離心后收集上清，并將標本保存于-20℃，且應避免反復凍融。

2．血清：標本請于室溫放置2小時后于1000 x g離心30分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

3．血漿：標本可采用肝素、EDTA或枸櫞酸鹽做為抗凝劑。標本采集后30分鐘內1000 x g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫。

1.         加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul，輕輕混勻，37℃，120分鐘。

2.         棄去液體，甩干，不用洗滌。

3.         每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。

4.         每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。

5.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘。

6.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應。用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

注：

1． 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4。測量時先用此孔調OD值至零。

2．為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層

吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據需要，重復此過程數次。
    自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

本試劑盒可同時檢測重組或天然的豬IL-8。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

靈敏度

本試劑盒測定豬IL-8的zui小可檢測檢測濃度（MDD），其值一般約為0.28 pg/mL

注意事項

1．  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2．  一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

3．  請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。

4．  如標本中IL-8含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數。

5．在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

檢測范圍：

15.6 pg/mL – 1000 pg/mL

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。

2．有效期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

4．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。

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