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Elisa樣本處理方法

2010年12月16日 11:23:46人氣:412來源:武漢貝茵萊生物科技有限公司

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【資料簡介】

樣品前處理

腦組織

1.  聚集的Aβ(阿滋海默癥病人的腦組織)

①1g腦組織切碎后加5倍體積的TBS,用均質器均質(10次)。 組織勻漿500000×g,4℃離心20分鐘。

TBS:50 mmol/L Tris-HCl ,  pH 7.6, 150 mmol/L NaCl ,  蛋白酶抑制劑 [0.1 mmol/L 二異丙基氟磷酸鹽 , 0.5 mmol/L 苯甲磺酰氟 , 1 g/mL甲苯磺酰-L-賴氨酸氯甲基酮鹽酸鹽, 1 g/mL抗痛素, 0.1 g/mL亮肽素]

②沉淀物懸浮與5倍體積的TBA/蛋白酶抑制劑(含1 mol/L蔗糖),500000×g,4℃離心20分鐘。

③沉淀物中加入3倍體積的1%Triton X-100/TBS/蛋白酶抑制劑,勻質(10次)。37℃孵育15分鐘后,500000×g離心20分鐘。

④沉淀物和勻質物中加入3倍體積的2%SDS/TBS/蛋白酶抑制劑到。組織勻漿37℃孵育15分鐘后,500000×g 25℃離心。

⑤沉淀物中加1mL 70%蟻酸到,超聲破碎后500000×g 4℃離心

⑥收集上清液并用離心濃縮(Speed Vac)干燥。加100μL DMSO并短時超聲破碎成懸液。零下80℃儲存這個DMSO-蟻酸溶解的Aβ溶液直到使用。

⑦檢測時,依照說明書所寫,用試劑盒中的標準稀釋液溶解樣本。推薦稀釋度是Aβ40稀釋1,000倍,Aβ42稀釋100倍。

2. 可溶Aβ(正常腦組織)

2-1. 使用70%蟻酸

①150mg組織加入1mL 70%蟻酸中勻質(敲6次)后100,000×g離心1小時。

②用1 mol/L Tris二十倍稀釋上清液

③用試劑盒中的標準稀釋液稀釋樣品后,按照說明書所述方法檢測。

2-2. 使用5.0 mol/L鹽酸胍

①組織加入10倍體積預冷的L鹽酸胍溶液(5.0 mol/L / 50 mmol/L Tris-Cl, pH8.0)后勻質,室溫下3~4小時。

②組織勻漿中加入10倍體積的預冷酪蛋白緩沖劑(0.25%干酪素/  0.05% */ 20μg/ml*/ 5 mmol/l EDTA, pH8.0 / 10μg/mL亮肽素,溶于PBS),16,000×g,4℃離心20分鐘。

③用試劑盒中的標準稀釋液稀釋上清液后,按照說明書所述方法檢測。

細胞培養上清液

根據需要用試劑盒中的標準稀釋液稀釋樣品,然后按照說明書所述方法檢測。推薦稀釋濃度是Aβ40稀釋5倍,Aβ42無需稀釋。

腦脊液

根據需要用試劑盒中的標準稀釋液稀釋樣品,然后按照說明書所述方法檢測。推薦稀釋濃度是50倍。

血漿

①用EDTA2K離心收集在真空血液收集管中的血液,5,000×g,15分鐘,4℃,分離血漿樣品,然后儲存在零下80℃直到使用。

②用試劑盒中的標準稀釋液4倍稀釋血漿以避免血漿中的干擾物質影響檢測,按照說明書方法檢測。

 

武漢貝茵萊生物科技有限公司作者

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