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組織培養(yǎng)細(xì)胞染色體制備

2016年11月13日 20:57:36人氣:832來(lái)源:上海士鋒生物科技有限公司

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關(guān) 鍵 詞組織培養(yǎng)細(xì)胞染色體制備
【資料簡(jiǎn)介】

組織細(xì)胞用于遺傳學(xué)分析zui常見(jiàn)的是體外培養(yǎng)的細(xì)胞株,多為惡性腫瘤細(xì)胞株,且呈貼壁生長(zhǎng),僅小數(shù)細(xì)胞株為懸浮生長(zhǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞有來(lái)源易得、細(xì)胞分裂率高和染色體標(biāo)本制出清晰度高等優(yōu)點(diǎn)。組織細(xì)胞染色體制備的關(guān)鍵是掌握好體外細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài),只有處在對(duì)數(shù)生的細(xì)胞才能出現(xiàn)較高的分裂相,所以積水仙素處理的時(shí)機(jī)及量是染色體標(biāo)本形態(tài)及分裂指數(shù)的關(guān)鍵。 
1、 實(shí)驗(yàn)材料 
培養(yǎng)液(PRMI 1640、M199、DMEM等),小牛血清、0.025%胰蛋酶、秋水仙素,刻度離心管,直吸管及彎頭吸管,培養(yǎng)瓶或皿、KCL、甲醇、冰乙酸、載玻片。 
2、 培養(yǎng)液配制 
培養(yǎng)液 85-95% 
小牛血清 5-15% 
雙抗(選擇) 100u/ml 
3、 操作過(guò)程 
(1)培養(yǎng)細(xì)胞:選擇處于指數(shù)生、用大瓶培養(yǎng)的80-90%匯合單層培養(yǎng)細(xì)胞; 
(2)終止培養(yǎng):當(dāng)有大量圓形發(fā)亮細(xì)胞出現(xiàn)時(shí),加秋水仙素0.01-0.03ug/ml培養(yǎng)混合液,置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)6-10小時(shí)以抑制分裂期細(xì)胞停止于分裂中期;(3)聚集細(xì)胞: 
(A) 搖動(dòng)法: 
可利用分裂中期細(xì)胞變圓與底物附著不牢特點(diǎn),此時(shí)可持培養(yǎng)瓶,左右反復(fù)橫向水平搖動(dòng),可使90%的中期分裂細(xì)胞從瓶壁脫落; 
(B) 消化法: 
將培養(yǎng)液倒入離心管內(nèi),給培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加0.025%液0.5-1ml/瓶,水平左右搖動(dòng),便培養(yǎng)瓶底壁面*接觸消化酶,稍后用彎頭吸管吹打,待細(xì)胞*脫落后,加入3-5ml前培養(yǎng)終止消化。用吸管移入裝有培養(yǎng)液的離心管內(nèi)2000rpm10分鐘。棄上清液,留沉淀細(xì)胞; 
(4)低滲處理:給沉淀細(xì)胞加頂溫的37℃0.075MKCL8ml左右,用吸管打均勻,在溫箱中靜置20-30分鐘; 
(5)預(yù)固定:向低滲處理適當(dāng)?shù)碾x心管中加新鮮配制的3∶2甲醇,冰乙醇固定液1-2ml,用吸管輕松吹打調(diào)勻,此措施能起到使細(xì)胞表面輕微固定,可防止固定后細(xì)胞粘連成塊。 
(6)固定:800-1000rpm10分鐘,棄上清液加新鮮配制的3∶2甲醇冰乙酸固定液10ml,加入時(shí)要沿管壁慢慢加入,后輕輕吹打,封口后室溫靜置30分鐘以上,反復(fù)三次; 
(7)制片:末次離心后,倒掉上清液,留沉淀細(xì)胞,加新鮮配制固定液0.5ml左右,混勻后制片,其它同外周血方法。

上海士鋒生物科技有限公司作者

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