在大腸桿菌（E.Coli）表達(dá)蛋白產(chǎn)物

【資料簡介】

一、原理
1、 E . coli 表達(dá)系統(tǒng)
E . coli 是重要的原核表達(dá)體系。在重組基因轉(zhuǎn)化入E . coli 菌株以后，通過溫度的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，將表達(dá)樣品進(jìn)行SDS-Page 以檢測表達(dá)蛋白質(zhì)。
2、 外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)
提高外源基因表達(dá) 水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長與外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，以減輕宿主菌的負(fù)荷。常用的有溫度誘導(dǎo)和藥物誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)采用異丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。
不同的表達(dá)質(zhì)粒 表達(dá)方法并不*相同，因啟動(dòng)子不同，誘導(dǎo)表達(dá)要根據(jù)具體情況而定。

二、材料
1、誘導(dǎo)表達(dá)材料
( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培養(yǎng)基
酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g
NaCl 10g 瓊脂 (Agar) 1-2%
蒸餾水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0
適用范圍：大腸桿菌
( 2 ) IPTG 貯備液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸餾水中，0 . 22 μm 濾膜過濾除菌，分裝成1 mL /份，－20 ℃ 保存。
( 3 ) l× 凝膠電泳加樣緩沖液：
50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )
50 mmol / L DTT
2 % SDS （電泳級）
0.1 ％ 溴酚藍(lán)
10 ％ 甘油
2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料
1 ）酶溶法
（1）裂解緩沖液：
50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )
1 mmol / L EDTA
100 mmol / L NaCI
（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
（3）10 mg / mL *。
（4）脫氧膽酸。
（5）1 mg / mL DNase I。
2 ）超聲破碎法
( 1 ) TE 緩沖液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液：
100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )
100 mmol / L DTT
4 % SDS
0.2 ％ 溴酚藍(lán)
20 ％ 甘油
三、實(shí)驗(yàn)方案
1、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)
( 1 ）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化載體DNA 和目的基因。
( 2 ）按連接步驟連接目的基因和載體，并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌。
( 3 ）篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落，提取質(zhì)粒DNA 作限制性內(nèi)切核酸酶圖譜，DNA 序列測定，
確定無誤后進(jìn)行下一步。
( 4 ）如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為PL 啟動(dòng)子，則在30 -32 ℃ 培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，使培養(yǎng)液的OD600達(dá)0.4-0.6 ，迅速使溫度升至42 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h ；如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為tac 等，則37 ℃培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)小時(shí)達(dá)到對數(shù)生*后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L。繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h 。
( 5 ）取上述培養(yǎng)液1 mL , 1000g 離心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后，作SDS -PAGE 檢測。
2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化
1 ）細(xì)菌的裂解
常用方法有：① 高溫珠磨法；② 高壓勻漿；③ 超聲破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化學(xué)滲透等。前三種方法屬機(jī)械破碎法，并且方法① 、② 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用，后三種方法在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實(shí)驗(yàn)步驟。