*酰化探針的檢測實驗

【資料簡介】

比色法
實驗材料    DNA
試劑、試劑盒    磷酸酶緩沖液封阻液牛血清蛋白TENBT
儀器、耗材    離心機分光光度計搖床
實驗步驟    
1.  用DNA稀釋緩沖液，稀釋*酰化標準DNA，濃度為0、1、2、5、10和20 pg/μl。以同樣稀釋液處理待測DNA。

2.  對干硝酸纖維素濾膜：每個稀釋度取1 μl 點膜，在80℃供干約1 h接步驟4。
 
3.  對于足龍膜：每個稀釋度取1 μl 點膜，晾干后用紫外照射法將DNA交聯至膜上。接步驟4或化學發光檢測。
 
4.  用少量體枳AP7.5液沆膜1 min，在密封袋中（剪成合適大小），用10 ml 封阻液，37℃封閉1 h 注意排出氣泡。

5.  稀釋10 μl 親和素-AP交聯物至10 ml AP7.5。剪去封閉袋一角擠出封閉液，用親和素-AP交聯物代替，重新封口，在旋轉平臺室溫揺蕩10 min。

6.  從袋中取出濾膜移到一個淺盤中，用200 ml AP7.5冼2次，每次15 min。再用 200 ml AP9. 5洗1次，10 min，輕微搖蕩。

7.  加入33 μl 75mg/ml 的NBT至7.5 ml AP9.5液中，混勻。再加入25 μl 50 mg/ml BCIP，混勻。

8.  在淺盤中避光溫育溶液，不時觀察直至發色達到滿意程度為止。
 
9.  加TE pH8.0以終止反應，比較測定DNA樣品和標準DNA的顏色強度以確定*酰化dNTP的摻入效率。如果該探計至少有一半標準品的強度，它可作為探針用于原位雜交。
化學發光法
實驗材料    DNA
試劑、試劑盒    *磷酸酶
儀器、耗材    紫外燈離心機
實驗步驟    
1.  用夾子固定已轉印的尼龍膜的邊角于一小片干的吸水紙上，樣品面朝上，放進溫箱內12~80℃放15~30 min 或溫室晾干過。
 
2.  將帶核酸的面朝上暴露于紫外燈下，用zui適的時間交聯。

3.  用*探針與膜雜交，用適當強度的洗液洗滌。
 
4.  雜交后、將膜置于雜交袋中。
 
5.  封口，在一個角留有一小孔便于加入和排出液體。

6.  加入1體積的封阻液、室溫作1 min 輕微搖動、倒干溶液。
 
7.  加入1 mg/ml 鏈親和素至1體積的封阻液至終濃度為1 μg/ml，在雜交袋中室溫溫育4 min，輕微搖動，倒干溶液。

8.  加入10體積詵液 I，室溫洗膜4 min 輕微搖動，倒干溶液，重復1次。

9.  加入*酰化堿性磷酸酶至1體積的封阻液，室溫作用4 min 輕微搖動、倒干溶液。

10.  用10體積洗液 I 洗膜2次，同步驟8。
 
11.  用0.5體積底物稀釋液稀釋化學發光底物，在雜交袋中室溫作用4 min 輕微搖動，打開雜交袋，盡可能倒干溶液。

12.  壓平雜交袋上的折皺，重新封口，結合核酸的一面向上，用一張X光片壓好，在暗盒內曝光10~20 min。