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區(qū)域特異性誘變實(shí)驗(yàn)
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關(guān) 鍵 詞 | 區(qū)域特異性誘變實(shí)驗(yàn) |
- 【資料簡(jiǎn)介】
實(shí)驗(yàn)材料 DNA
試劑、試劑盒 乙酸鈉*TE無(wú)水乙醇dNTP反轉(zhuǎn)錄酶RNA酶洗脫液溴化乙錠
儀器、耗材 水浴鍋培養(yǎng)箱
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 用限制性內(nèi)切核酸酶消化DNA以獲得目的DNA片段,將靶片段雙向克隆到M13噬菌體載體或含有M13復(fù)制起始子的質(zhì)粒載體中。從100 ml 感染細(xì)抱培養(yǎng)物中提取單鏈DNA。2. 在三個(gè)微量離心管內(nèi)各加入40 μg 1 mg/ml 的單鏈DNA,如果靶序列的兩條鏈都要被利用,則需用6個(gè)反應(yīng)。
3. 亞硝酸反應(yīng):在一個(gè)管內(nèi)加入10 μl pH4.3的2.5 mol/l 乙酸鈉和50 μl 2 mol/l *,混勻,室溫溫育60 min。4. 甲酸反應(yīng):在另一管內(nèi)加60 μl 濃甲酸,混勻,室溫溫育10 min。
5. 肼反應(yīng):在第三個(gè)管內(nèi)加60 μl 濃肼,混勻,室溫溫育10 min。
6. 毎管加100 μl 2.5 mol/l pH5.5的乙酸鈉,30 μg 擔(dān)體tRNA和1 ml 無(wú)水乙醇,置干冰中凍至-80℃,放置10 min,離心10 min,去上清,重復(fù)乙醇沉淀兩次,再用80 μl TE緩沖液重懸DNA。
7. 在重懸的DNA內(nèi)加10 μl 4種dNTP混合液,10 μl 10×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液和100 pmol 的寡核苷酸引物。先在85 ℃溫育5 min,再于40℃溫育15 min。
8. 加10 μl 4種dNTP混合液和30~40 U 的AMV反轉(zhuǎn)錄酶,37℃溫育1 h。
9. 用緩沖液平衡酚抽提和乙醇沉淀DNA,DNA重懸于100 μl 10×限制性內(nèi)切酶緩沖液,并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割,以便從載體中回收片段。
10. 酚抽提和乙醇沉淀DNA。DNA重懸于10~15 μl 洗脫緩沖液,并加0.5 μl 2 mg/ml RNA酶A,37℃溫育15 min 以降解擔(dān)體tRNA。
11. 在非變性的6%聚丙烯酰胺凝膠電泳上,分離從載體上切下的目的片段,凝膠用溴化乙錠染色,切膠,洗脫出DNA。12. 將純化的插入DNA連接到具有互補(bǔ)末端的質(zhì)?;蚣?xì)菌噬菌體載體中。通過(guò)常規(guī)的轉(zhuǎn)化程序?qū)⑦B接混合物導(dǎo)入合適的細(xì)菌中。
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