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Southern blot實驗

2015年06月10日 13:32:19人氣:221來源:上海彩佑實業有限公司

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關 鍵 詞Southern blot實驗
【資料簡介】

實驗方法原理    互補的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對形成穩定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的,可以根據所使用的探針已知序列進行特異性的靶序列檢測。雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細胞總DNA或總RNA。根據使用的方法被檢測的核酸可以是提純的,也可以在細胞內雜交,即細胞原位雜交。分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上,然后用放射性或非放射性標記的探針與被固定的模板雜交,經顯影或現色后檢測出目的DNA或RNA 分子所處的位置。
實驗材料    基因組DNAPCR產物
試劑、試劑盒    EcoR l 反應bufferTBEDNA landing buffer變性液SSC轉移液Washing bufferdetection buffermaleic acid buffer
儀器、耗材    eppendorf 管Tip頭PCR儀無粉手套水平電泳儀轉移槽尼龍膜吸水紙及濾紙
實驗步驟    
1.  基因組DNA限制性內切酶酶切
 
(1)設置50 ul 反應體系,在200 ul EP管中加入:
 
10 ug 基因組DNA    x ul
去離子水    49-x ul
10×buffer    5 ul
EcoR Ⅰ    4 ul

 
(2)充分混勻,離心20 s。
 
(3)置于PCR議上37℃反應過。
 
(4)加1/10體積乙酸鈉、2體積無水乙醇沉淀DNA晾干。
 
(5)加20 ul TE buffer溶解DNA。
 
2.  DNA瓊脂糖凝膠電泳
 
(1)用0.5×TBE buffer配制0.8%瓊脂糖凝膠,微波爐加熱至溶化,加入EB(0.5 ug/ml)混勻后倒入制膠器中室溫凝固。
 
(2)凝固后,去除樣品梳及膠帶,置于水平電泳儀中。
 
(3)將DNA樣品用6×DNA landing buffer 混勻后加入樣品孔中,恒壓電泳(20 V/10 mA)直至染料電泳至邊緣。
 
(4)電泳完畢,取出凝膠切角并在凝膠成像系統成像記錄。
 
3.  DNA轉移與固定
 
(1)凝膠置于0.25 M HCl中處理30 min,去離子水洗1次。
 
(2)堿變性:凝膠置于0.4 M NaOH變性液中作用20 min。
 
(3)毛細管法轉移:根據凝膠大小裁剪與其等大小尼龍膜、濾紙片,尼龍膜一角軟鉛筆作方位標記。
 
(4)去離子水浸泡尼龍膜、濾紙片,中再浸泡5 min。
 
(5)按下圖安裝轉移槽進行轉移過(0.4 M NaOH轉移液)。
 
(6)轉移完畢后取出尼龍膜,2×SSC浸泡5 min,濾紙吸干,夾在2層干凈濾紙。

 
4.  預雜交與雜交
 
(1)預雜交:將尼龍膜置于預熱DIG Easy Hyb工作液(37℃~42℃)中搖晃充分作用30 min。
 
(2)探針變性:DIG標記探針煮沸5 min 后迅速置于碎冰中,用預熱DIG Easy Hyb工作液制備含探針的雜交液。
 
(3)棄去預雜交液,加入雜交液42℃搖動孵育4小時或過。
 
(4)2×SSC(in 0.%SDS)洗膜2次(5 min×2),不斷搖動。
 
(5)5×SSC(in 0.%SDS)洗膜2次(155 min×2,65~68℃),期間不斷搖動。
 
5.  雜交檢測
 
(1)Washing buffer潤洗1遍(3~5 min)。
 
(2)100 ml blocking buffer工作液封閉30 min。
 
(3)100 ml antibody buffer(1:5000)孵育30 min。
 
(4)Washing buffer洗膜(15 min×2)。
 
(5)20 ml detection buffer 平衡2~5 min。
 
(6)將尼龍膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中,避光數min至1天(出現顏色時不要搖動)。
 
(7)當出現條帶時,TE-buffer洗膜(5 min×1),終止現色。
 
(8)照相記錄,80℃烤干,儲存。
 
(9)掃描計算EGFR基因擴增的倍數。
收起 
注意事項    
1.為了防止緩沖液流從凝膠邊緣之外通過,沿凝膠的每一邊放置一條 Parafilm膜,使濾紙橋與層疊上部的吸濕材料無法接觸。 

2.核酸轉移的選擇尼龍膜比NC膜好,是目前較理想的核酸固相支持膜。

3.尼龍膜漂洗盡量*,可降低背景。

4.color-substrate solution要新鮮配制。

5. Tm = 49.82 + 0.41 (% G + C) - (600/l) [l = length of hybrid in base pairs], Topt. = Tm –20 to 25° C(The given numbers of the equation were calculated according to a standard(The given numbers of the equation were calculated according to a standard equation for hybridization solutions containing formamide, 50%.) The actual hybridization temperature Topt. for hybridization with DIG Easy Hyb is 20-25° C below the calculated Tm value. Topt. can be regarded as a stringent hybridization temperature allows up to 18% mismatches between probe and target. When the degree of homology of your probe to template is less than 80%, you should lower Topt. accordingly (approx. 1.4°C below Tm per 1 % mismatch) and alsoadjust the stringent washing steps accordingly (i.e. increase SSC concentration and lower washing temperature).

上海彩佑實業有限公司作者

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