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酵母雙雜交實驗常見問題

2015年04月01日 07:47:42人氣:622來源:上海士鋒生物科技有限公司

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【資料簡介】

1.如果誘餌蛋白對酵母細(xì)胞是有毒的,該怎么辦?

在某些情況下,在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)不好的菌珠可以在固體培養(yǎng)基上生長得很好。首先重懸克隆于1ml的SD/–Trp,接著將重懸液平鋪于5 個100-mm的SD/–Trp平板,在30℃下溫浴,直至平板上的克隆相互粘在一起。用5ml 0.5X YPDA刮下每塊板上的克隆,并收集到一管中,這樣就可以使用這個細(xì)胞重懸液進(jìn)行正常的雜交反應(yīng)。

2.如果誘餌蛋白能直接激活報告基因的表達(dá),該如何處理?

該蛋白很可能有轉(zhuǎn)錄激活域,是個轉(zhuǎn)錄因子。可以通過基因重組切掉轉(zhuǎn)錄激活域,然后重新檢測其是否自激活,但要注意重組也有可能破壞蛋白之間的互作。

3.轉(zhuǎn)化效率太低怎么辦?

可以采用以下方法解決:

1)檢測一下DNA的純度,如果可以的話,重新用乙醇純化。

2)DNA-BD/誘餌蛋白很可能是有毒的。

3)不適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基,重新配制培養(yǎng)基,并做對照轉(zhuǎn)化。

4)檢測pGBT9對照載體的轉(zhuǎn)化效率,放置于SD/–Trp平板上,轉(zhuǎn)化效率應(yīng)該在1 x105 colonies/mg DNA以上。

4.雜交效率不高,該如何處理?

在雜交中,預(yù)轉(zhuǎn)化的誘餌細(xì)胞的數(shù)量可能不夠。當(dāng)對誘餌菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)過夜時,應(yīng)挑選大的、新鮮的克隆進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)過離心和重懸后,再使用血球計對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。密度應(yīng)該在1 x109/ml。

一個甚至兩個融合蛋白對酵母細(xì)胞有毒。你可以通過重組方法來減輕毒性,同時又能保證蛋白的相互作用。或者使用表達(dá)水平較低的載體。也可以在瓊脂平板或濾膜上進(jìn)行雜交。但同時必須作雜交對照實驗。

上海士鋒生物科技有限公司作者

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