堿性磷酸酶鈣―鈷法

【資料簡介】

   磷酸 酶(phosphatase)是水解磷酸酯酶的總稱。磷酸酶不僅參與磷酸酯化合物的水解反應。而且也參與其逆反應及磷酸轉移反應。

    1．堿性磷酸酶  堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)在堿性環境下可催化各種酚和醇的磷酸酯水解，還具有磷酸轉移作用，在細胞膜上運輸作用較為活躍，如腎近端小管的刷狀緣、小腸上皮的微絨毛、肝臟的膽小管、毛細血管內皮細胞及神經元的突觸膜均可顯示此酶活性。

    在堿性環境(；pH 9．2～9．4)中，堿性磷酸酶將磷酸鹽的底物(如β-，α-萘酚磷酸鈉)分解，產生的磷酸離子被孵育液中的鈣離子捕獲生成磷酸鈣沉淀。因磷酸鈣不能顯色，需加入硝酸鈷，用鈷離子置換鈣離子，形成磷酸鈷沉淀后用硫化銨處理，形成棕黑色硫化鈷顆粒沉淀，從而顯示酶活性部位，硫化鉆沉淀的多少與堿性磷酸酶含量成正比，其反應通式

堿性磷酸酶鈣-鈷法反應原理

1)孵育液配制

    2％氯化鈣          20ml

    2％鈉        10ml

    3％β    10ml

    5％          5ml

    蒸餾水             5ml

    孵育液zui終pH 9．4,置于冰箱內保存。

    2)染色程序：①新鮮組織恒冷箱切片(可用10％福爾馬林固定10分鐘，或不固定)；②人孵育液，37C~孵育10分鐘(腎)至 60分鐘(肝)；③流水沖洗；分鐘；④人2％硝酸鈷溶液2分鐘；⑤蒸餾水浸洗；⑥人1％硫化銨溶液內1分鐘；⑦蒸餾水洗；⑧甘油明膠封固。

    3)結果與評價：酶 活性部位顯示棕黑色為硫化鈷沉淀。該法的反應產物可發生擴散，定位欠準確，應加以注意。

    4)對照實驗：加入抑制劑L四咪唑等結果為陰性；去底物(孵育液中用10ml蒸餾水代替底物)結果為陰性。