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Feulgen反應原理及Sohiff液的配制
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- 【資料簡介】
Feulgen 反應原理及 Sohiff 液的配制
Feulgen 反應是顯示DNA的經典而特異的染色方法,由Feulgen(孚爾根)在1924年提出,因而得名。
(一)Feulgen反應原理
DNA 可在酸性條件下水解,嘌呤―脫氧核糖之間的糖苷鍵斷開,形成醛基(―CHO),再用 顯示醛基的特異性試劑Schiff試劑處理,形成光鏡下所見的細胞核內紫紅色反應產物。DNA 經處理而水解。除可破壞脫氧核糖與嘌呤堿外,還可水解嘧啶堿。酸水解核酸的程度與 水解時間長短有關,隨著水解時間的延長,嘌呤堿基增多,形成的醛基也隨之增多,Feulgen反應加強。如果水解時間過長,DNA將*水解,反而使Feulgen反應減弱。DNA水解時間因組織種類和固定液不同而異,需通過預實驗找到合適的水解溫度和時間。由于Schiff試劑能與醛基結合,故不能用含醛的固定液固定組織,常用Carnoy固定液。Bouin液不適用于Feulgen反應,因為固定液中含較多的酸,可將DNA水解,影響染色反應。
Schiff試劑是顯示醛基的特異試劑,其反應原理是堿性品紅(為紅紫色)經亞硫酸處理后變為五色Schiff液,Schiff液遇到醛基時,則被還原形成原有的顏色,即紅紫色。堿性品紅結構中的醌基是堿性品紅中具有紫紅色的核心結構,經亞硫酸處理后,則醌基兩端的雙鍵打開,形成五色品ii-硫酸復合物為Schiff試劑。如果加熱使SO2逸出,則恢復品紅原來的顏色而失去對DNA的染色效果,故配好的Schiff試劑應避免SO2 逸出。
Feulgen反應原理
(二)Sohiff液的配制
將lg堿性品紅溶于200ml煮沸的蒸餾水中,使其*溶解,然后冷卻到60℃過濾。加入30ml 1N HCl和3g焦亞硫酸鉀(K:S:();)或亞硫酸鈉,塞緊瓶塞,置于暗處或外包黑紙24小時。1N HCl與焦亞硫酸鹽生成的SO:將溶液中堿性品紅脫色成為無色堿性品紅(即白亞磺酸)。如溶液尚有淺黃色,可用0.5g活性炭脫色,搖動幾分鐘后迅速用粗濾紙過濾.濾液應為清亮五色。制成的Schiff試劑應置于棕色瓶中,瓶塞需擰緊并用黑紙包裹,避光保存于4℃,保質期可達半年。若暴露于空氣,或加熱則使Schiff試劑中的S02 逸出,變性的Schiff試劑則不能使用。除堿性品紅外。其他堿性染料也可制成能與醛基反應的類似Schie 反應液,但是。不能達到五色。在染色時可用l%鹽酸乙醇洗去不起反應的余色。Schiff試劑在不同的pH條件下可顯示不同的物質,如Sehiff試劑在pH 3.0~4.3時,對Feulgen反應效果好,而pH 2.4時,對PAS(糖原)反應效果好。
注意:Schiff試劑雖無色,但氧化后為紫紅色。同時要防止污染環境,用后要回收。
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