反轉錄病毒產毒細胞系建立實驗

【資料簡介】

建立一個能產生高水平的反轉錄病毒構建體的細胞系是一個*的過程。首先，必須將反轉錄病毒構建體穩定地導入一種適當的包裝細胞系中。當產生了穩定的細胞系后，必須對之進行鑒定，從中選出能產生具有正確結構的高滴度的病毒的細胞系。
實驗材料    包裝細胞系
試劑、試劑盒    HEPESCaCl2甘油DMSO
儀器、耗材    培養皿培養板離心機
實驗步驟    
1.  在轉染前1天，在10 cm 培養皿中接種包裝細胞，接種密度大約相當于10%~20%片的細胞數。

2.  將10 μg 含有藥物抗性基因的反轉錄病毒質粒DNA加入0.5 ml HeBS。再加入32 μl 2 mol/l CaCl2并同時輕輕搖晃。用手指輕彈試管外壁約 30 s，然后在室溫下溫育45 min，直到形成細小的淡藍色沉淀。

3.  移去包裝細胞的培養液，吸取HeBS-DNA沉淀輕輕加在培養皿的*。在組織培養操作櫥內讓細胞接觸DNA 20 min，大約10 min 后，輕輕轉動培養皿以均勻分散DNA溶液，加10 ml 培養液，將細胞置于37℃溫育4 h。

4.  吸盡培養液，輕輕加入2.5 ml 室溫的HeBS/甘油溶液。將培養血放回培養箱中溫育3.5 min 或90 s，或對于特定細胞經測定的合適的溫育時間?？焖贄壋鼿eBs/甘油溶液，細胞用10 ml 培養液輕輕清冼， 重復用培養液清洗1次，加5 ml 含有血清的培養液，培養18~24 h。

5.  移出培養液，用0.45 μm的濾器過濾，獲得的上清含有短暫產生的病毒；將其貯存于 -70℃或-80℃，或者立即用于感染另一個帶有不同類別的包膜基因的包裝細胞系， 以產生一個被感染的產生病毒的細胞系。
 
6.  在轉染的細胞中加10 ml 培養液，培養2~3天，然后繼續步驟10。
 
7.  在感染前1天，將包裝細胞系按1：10至1：20傳代。
 
8.  移去將要感染的包裝細胞系的培養液。加病毒如下：用于感染一個10 cm 的培養皿上的細胞，稀釋0.1~1.0 ml 毒原液至終體積3~5 ml 并加800 μg/ml 的polybrene至8 μg/ml；如感染一個6 cm 的培養皿，稀釋0.1~1 ml 病毒原液至終體積2 ml，并加800μg/ml  的polybrene至終濃度8 μg/ml 溫育1 h。
 
9.  對于10 cm 培養皿則，加培養至終體積10 ml，對于6 cm 培養皿則加4 ml。培養2~3天。
 
10.  在轉染或感染后2~3夭，將轉染的或惑染的細胞按1：10或1：20傳代， 加選擇培養液，培養3天。換新的選擇培養液，再培養4~7天直至可見到細胞克隆。

11.  用克隆圓柱體挑取分隔良好的細胞克隆，每個克隆轉移至2個24孔培養板或6孔培養板的培養孔中。生長至50%~90%匯片。

12.  移去培養液，換成1/2體積的培養液。視包裝細胞系不同而培養1~3天，移出培養液，立即對其進行直接滴定，或貯存于-70℃或-80℃。

13.  繼續傳代各產病毒細胞克隆，直至其可凍存，和（或）直至鑒別出的產病毒細胞。當鑒定出一個好的產病毒細胞克隆時，細胞分裝在20~25支凍存管（1~2 ml 每支） 中，培養液含10%~50%DMSO，在液氮中凍存。
收起 
注意事項    
1.  如果轉染的目的是為了生成穩定的產病毒細胞系，有兩種選擇。*種選擇是從那些已經穩定整合了載體質粒的轉染細胞中進行選擇。這些細胞可置于藥物選擇之下，對產生的藥物抗性細胞進行產毒篩選。第二種選擇是用“交叉感染"的包裝細胞系。上述第5步中收集到的短暫產生的病毒可用來感染另一個包裝細胞系，如步驟7~9。其后被感染的包裝細胞可置于藥物選擇之下。無論用哪種方法，目的都是為了分離穩定整合了病毒基因組并產生可能的zui高滴度的包裝細胞。

2.  這個方法較用轉染的細胞方法可能更受次迎，因為由感染而產生的前病毒常常是與宿主基因組穩定地并在整合后不發生重排或丟失。用這種方法時必須用表達不同類別的病毒糖蛋白的兩種包裝細胞系，當一個包裝細胞系產生一種持定的env搪蛋白時，該包裝細胞的表面的受體就被那種病毒糖蛋白結合而被阻斷。當用交叉感染時，兩種包裝細胞系必須是同源的。

測定病毒滴度
實驗材料    病毒原液
試劑、試劑盒    G418
儀器、耗材    離心機培養箱
實驗步驟    
1.  感染的前1天按1：10至1：20將靶細胞NIH 3T3分傳于6 cm 培養皿中。
 
2.  進行感染的當天，移去靶細胞的培養液，加入含有病毒原液的培養液。用1~2 ml 含 有0.01 μl~0.1 ml 病毒原液的培養液感染6  cm 培養中的細胞，或3~5 ml 感染10 cm 培養皿中的細胞。對于鼠源性的或禽源性的E亞群，加800μg/ml 的polybrene至終濃度8μg/ml，在37℃溫育細胞1~3 h。
 
3.  用培養液稀釋polybrene至2 μg/ml，并培養至少2或3個細胞周期。
 
4.  如果病毒攜帶了一個組織化學標記基因如lacZ則感染的細胞可用Xgal染色，不需要進行藥物選擇。計數藍染的細胞，接著按步驟7計算滴度。

5.  如果病毒攜芾了藥物抗性基因，將感染的細胞分傳入選擇培養液中。如果抗性基因是neo將細胞按1：10至1：20傳代，分傳入2個各含有G418的10 cm 的培養皿中，培養3天。
 
6.  換液，內含適當的選擇藥物。共培養7~10天，屆時應可見到細胞克隆。在克隆擴散之前計數其數目

7.  按如下公式計算滴度（RCFU表示抗性CFU）

 

或，如果病毒攜帶lacZ基因，

 

 

粗略的估計是，病毒滴度的變化大于3倍即為有顯著差異。

8.  用一種分析方法證明產病毒克隆所產生的病毒沒有發生重排或丟失。