上海酶聯生物研究所作者
如何地轉染胚胎干細胞
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如何地轉染胚胎干細胞?
Bio-Rad公司近日在其上發布了一篇技術指南,是由美國得克薩斯大學健康科學中心的Eva Zsigmond撰寫的,講述的是如何利用Gene Pulser Mxcell電穿孔系統轉染小鼠和人的胚胎干細胞。
此技術指南(編號為5904)研究了電穿孔參數的優化,以更地將DNA導入小鼠胚胎干細胞和人胚胎干細胞,這些細胞是在克隆形成和無滋養層的條件下生長的。電穿孔是將基因導入小鼠胚胎干細胞的理想方法。使用已經確立的電穿孔參數,小鼠ES細胞能夠率地穩定轉染,在多能性和核型穩定性方面沒有不良影響。然而,與小鼠胚胎干細胞相比,人胚胎干細胞在電穿孔后存活率和轉染效率都要低一些。
目前關于電穿孔人胚胎干細胞的文獻不多,且大部分方法都是針對特定的細胞系或基因座,很難推廣到所有干細胞。于是,Zsigmond的研究小組想要優化電穿孔參數,將DNA導入無滋養層條件下的ES細胞。
與其它系統相比,Bio-Rad的Gene Pulser Mxcell電穿孔系統的主要優勢在于除了目前的程序,每個關鍵參數都是可編程的,從電壓到脈沖次數,讓研究人員能夠找到特定細胞的條件,包括難轉染的原代細胞和干細胞。此外,該系統是96孔板形式,能篩選不同的電穿孔條件。
Gene Pulser Mxcell電穿孔系統采用開放的架構,允許Zsigmond的研究小組確定小鼠及人胚胎干細胞轉染的*步驟,同時優化細胞存活率。研究人員保持DNA濃度恒定,細胞密度相近,采用不同的電壓(250 V和300 V)以及不同的電容參數(100 μF、200 μF、300 μF和950 μF)來檢測轉染效率和存活率。
研究表明,電容在200 μF時,細胞存活率和GFP表達都為zui有利的水平,而低電壓(250 V)時的存活率略高于高電壓。研究人員鑒定出人ES細胞的*電穿孔條件為電壓250 V,電容 200 μF,電阻 1000 Ω及指數波形。不過這些結果還需要進一步的驗證。
研究人員認為電穿孔是將DNA導入細胞的簡單且有效的方法,且實驗中針對無滋養層的ES細胞的電穿孔條件可能對未來的臨床應用很重要。
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