人Ⅱ型膠原 （COL-2）酶聯(lián)免疫試劑盒使用說明

【資料簡介】

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人Ⅱ型膠原 (COL-2)酶聯(lián)免疫試劑盒使用說明

 

 

 

 

本試劑盒適用于以下樣本的測試（黑底字體為適用樣本）：

 

血清、血漿- 組織勻漿 –腹水 –細胞培養(yǎng)上清

 

 

 

 

 

 

 

本試劑盒僅供研究，不用于臨床診斷

 

 

目錄

1. 實驗原理
2. 試劑盒組成
3. 試劑盒保存
4. 需要而未提供的試劑和器材
5. 試劑準備
6. 樣本前處理
7. 洗板方法
8. 詳細操作程序
9. 操作總結(jié)
10. 性能參數(shù)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. 實驗原理：本試劑盒采用競爭法法檢測樣本中Ⅱ型膠原 (COL-2) 的含量。向預(yù)先包被了抗體的酶標孔中加入樣本，再加入辣根過氧化物酶標記的識別抗原，在37℃下孵育1小時，兩者與固相抗原競爭結(jié)合形成免疫復(fù)合物，經(jīng)PBST洗滌后，結(jié)合的HRP催化TMB（四甲基聯(lián)苯胺）成藍色，隨后在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色，在450nm波長下有吸收峰，吸光值與樣本中抗原的濃度成負相關(guān)。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.試劑盒組成：

試劑盒組成	48孔配置	96孔配置	保存
說明書	1份	1份
封板膜	2片（48）	2片（96）
密封袋	1個	1個
酶標包被板	1×48	1×96	2-8℃保存
標準品：128ng/ml	0.5ml×1瓶	0.5ml×1瓶	2-8℃保存
標準品/樣品稀釋液	3ml×1瓶	3ml×1瓶	2-8℃保存
酶標試劑	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑A液	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑B液	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃保存
終止液	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃保存
濃縮洗滌液	（20ml×25倍）×1瓶	（20ml×25倍）×1瓶	2-8℃保存

備注：

• 試劑盒中“樣品稀釋液”為0.05M的PBS，“終止液”為2M的H2SO4，洗滌液為含0.15%吐溫-20的PBST，如不夠可自行配制。

b.不同公司的緩沖體系存在較大差異，請勿將本試劑盒的試劑與其他公司的試劑混用以免影響實驗結(jié)果。

c.濃縮洗滌液在低溫下會有少量鹽類析出，稍微加溫后即會消失，不影響使用。

 

3.試劑盒保存

• 2-8℃下保存6個月，在-20℃下可以保存更長的時間。酶標板為真空包裝，板條可以拆卸，拆開以后如一次不能用完，請放入提供的密封袋中，放入干燥劑，2-8℃保存，在一個月之內(nèi)仍然有效。試劑不能反復(fù)凍融。

4．需要而未提供的試劑和器材

1. 37℃恒溫箱。
2. 標準規(guī)格酶標儀。
3. 精密移液器及一次性吸頭
4. 雙蒸水或超純水
5. 干凈的試管或Eppendof管
6. 吸水紙
7. 自動洗板機或8道排槍
8. ELISA數(shù)據(jù)處理軟件，*使用ELISACalc
9. 500ml燒杯的和適當量程的量筒

 

 

 

 

 

 

 

5試劑準備

1. 使用前所有試劑應(yīng)置于室溫平衡至少30分鐘。
2. 本試劑盒可以直接加樣，如濃度過高，可以進行適當比例的稀釋（*2-5倍稀釋），計算時應(yīng)將結(jié)果乘以稀釋的倍數(shù)。
3. 洗滌液為25倍濃縮液，使用前將所有洗滌液倒入500ml或1L的燒杯中，用雙蒸水定容到500ml即為工作液。
4. 標準品的稀釋：取5支干凈的Eppendorf管，每管加150μl的標準品稀釋液，分別標記上64ng/ml，32ng/ml，16ng/ml，8ng/ml，4ng/ml .取150μl標準品原液加入標記64ng/ml 的管中，混勻后同樣取出150μl，加入下一管，以此類推直至zui后一管。零孔：直接加標準品/樣品稀釋液。（見下圖）

•     128ng/ml      64ng/ml，  32ng/ml，   16ng/ml，    8ng/ml，    4ng/ml

6樣本前處理

a.標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
b.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
c.血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
d.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
e.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
f.組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨笕匀槐３?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

1. 洗板方法

1. 手工洗板：先洗去酶標孔中的的液體，在吸水紙上拍干，然后每孔加入300μl稀釋好的洗滌液，輕輕搖晃30秒，然后甩掉，在吸水紙上拍干，重復(fù)4-5次。
2. 洗板機洗板：洗板機洗板比較便捷，但應(yīng)操作熟練后使用。
3. 詳細操作程序

1. 使用前請先將試劑盒在室溫下平衡半小時。
2. 空白孔不加樣，只加顯色劑A，B和終止液用于調(diào)零。
3. 標準品孔：每孔加入稀釋好的標準品50μl，零孔加入標準品/樣品稀釋液50μl，然后加入酶標試劑50μl。
4. 樣品孔：加入樣品50μl（*直接加樣，濃度高可以用樣品稀釋液稀釋2-5倍），然后加入酶標試劑50μl。
5. 輕輕搖晃，蓋上封板膜，37℃培養(yǎng)箱中孵育60min。
6. 將25倍濃縮洗滌液用蒸餾水25倍稀釋后備用。
7. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
8. 顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。
9. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
10. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進行。
11. 計算：根據(jù)濃度和OD值算出標準曲線的回歸方程，建議用計算軟件進行計算，*使用ELISAcalc進行計算，擬合模型選用logistic曲線（四參數(shù)）。標曲示意圖如下：

1. 操作總結(jié)

準備試劑，樣品和標準品

 

 

加入準備好的樣品和標準品，酶標試劑，37℃反應(yīng)60分鐘

 

洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10分鐘

 

加入終止液

 

10分鐘之內(nèi)讀OD值

 

計算

1. 性能參數(shù)

1. 批內(nèi)差：CV＜10%
2. 批間差：CV＜12%
3. 靈敏度：0.4ng/ml
4. 保存：    2-8℃
5. 規(guī)格：    96T/盒
6. 有效期：  6個月（2-8℃）。