成纖維細(xì)胞的分離技術(shù)

【資料簡(jiǎn)介】

 實(shí)驗(yàn)步驟

選擇大約一半足孕時(shí)間的胚胎，10-13天齡胚胎含有zui大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞可從這些細(xì)胞衍生獲得。

1. 胚胎的分離

   1） 適用哺乳動(dòng)物（倉(cāng)鼠、小鼠和大鼠）

a.采用認(rèn)可的方案處死嚙齒動(dòng)物

b. 立即在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)用70%乙醇擦洗整個(gè)動(dòng)物。若可能，置紫外燈下照射5min。

c. 用無(wú)菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無(wú)菌鑷子將皮膚扯向后退。

 d. 用另一無(wú)菌的剪刀和鑷子切開(kāi)腹部，去除含有胚胎的子宮，置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿上

e. 剔除胚胎周?chē)陌?，將胚胎放于無(wú)菌的含有無(wú)菌PBS的燒瓶中。

 f. 漂洗胚胎，去掉PBS。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。

   2） 適用雞胚胎

 a. 用70%乙醇擦洗雞蛋殼。

 b. 用無(wú)菌剪刀輕敲雞蛋的圓端，輕輕去除蛋殼露出氣囊。

 c. 用無(wú)菌鑷子去除覆蓋于絨毛尿囊上的白膜。

 d. 剪開(kāi)包膜，用彎鑷夾住胚胎頸部去除胚胎。

e. 棄頭部，將無(wú)頭的胚胎置于廣口燒杯中，用PBS漂洗。

2. 將6-8個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移至一個(gè)小的無(wú)菌廣口燒杯中，用新的無(wú)菌剪刀小心地絞碎胚胎，用PBS漂洗。

3. 在無(wú)菌狀態(tài)下，將絞碎的胚胎轉(zhuǎn)移于一500ml的無(wú)菌的有攪拌棒的燒杯中，加入200-300ml用HBSS配制的0.25%的無(wú)菌*。

4. 在溫暖的環(huán)境中或置于37℃培養(yǎng)箱中輕輕攪動(dòng)15min。

5. 讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降，將含有懸浮細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)移至一無(wú)菌大容積的離心管中，該管內(nèi)按照每10ml上清加入1ml牛血清的比例加入牛血清以滅火*。

6. 加入新鮮*溶液（見(jiàn)前述步驟）于含有殘留未消化組織塊的500ml燒杯中，重復(fù)步驟4和5。

7. 離心混合的細(xì)胞懸液，1200r/min，5min，棄上清。

8. 用新鮮的無(wú)菌PBS重懸沉淀的細(xì)胞，按步驟7再次離心。

9. 用PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞直至上清清亮為止。

10. 用含有10%牛血清和抗生素（如*、*）的DMEM 10ml再懸沉淀，并使終體積為100ml。

11. 讓殘留的大塊未破碎的組織或特殊顆粒物質(zhì)沉降?？刹捎脭?shù)層無(wú)菌紗布過(guò)濾細(xì)胞懸液以去除任何殘留的細(xì)胞快。

12. 為確定現(xiàn)有細(xì)胞濃度，加入0.2ml細(xì)胞懸液于1.8ml 1%醋酸溶液中以裂解紅細(xì)胞，用*進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

13. 按每10mm平皿1*10⁷至4*10⁷細(xì)胞的數(shù)量接種于10ml組織培養(yǎng)液中，在飽和濕度的37℃ CO₂培養(yǎng)箱中孵育直至細(xì)胞鋪滿(mǎn)。

14當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，去除培養(yǎng)液，用10%的溫暖的Versene（用PBS配制的0.53nmol/L EDTA），洗滌細(xì)胞層2次。

15. 棄Versene，加入相同體積的溫暖0.05%*-EDTA。

16. 37℃孵育5min。

17. 用無(wú)菌吸管輕輕吹散細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至一含有1-2ml牛血清的無(wú)菌管中。牛血清的終濃度約為10%，起到中和*的作用。

18. 離心，1200r/min，5min，棄上清。

19. 再懸沉淀于5ml培養(yǎng)液中，另加入15ml培養(yǎng)液，分裝于2個(gè)100mm平皿中。

20. 置37℃飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，直至細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)，繼續(xù)步驟14-20以傳代細(xì)胞。