熒光標(biāo)記mRNA差異顯示技術(shù)

【資料簡介】

摘要 目的：應(yīng)用熒光標(biāo)記的mBNA差異顯示技術(shù)。方法：提取未經(jīng)過／經(jīng)過IFN、LPS處理的三組人單核細(xì)胞系U937的總RNA并以此為模板，采用熒光標(biāo) 記的錨定引物，通過逆轉(zhuǎn)錄、差異顯示PCR反應(yīng)，經(jīng)5．6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離差異條帶，回收后將其再擴(kuò)增。結(jié)果：三組樣本的 DD-PCR產(chǎn)物電泳顯示長30 0 bp～2.0 kb不等的擴(kuò)增片段，條帶清晰、明亮，背景低，各樣本相互間的差異不僅呈有無的變化，亦表現(xiàn)出很多強(qiáng)弱改變；再擴(kuò)增條帶銳利、單一。結(jié)論：在本試 驗(yàn)室成功應(yīng)用了熒光標(biāo)記差異顯示技術(shù)，可快速、敏感、經(jīng)濟(jì)有效地篩選各種未知的表達(dá)基 因。

　　中圖分類號(hào)：　Q781文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： B

　　文章編號(hào)：1000-6834（200 0）04-0373-04

FLUORESCENT mRNA DIFFERENTIAL DISPLAY TECHNIQUE

WANG Gang-shi

　?。?span lang="EN-US">Department of Gastroenterology General Hospital of Chinese PLA , Beijing 100853;）

　　WANG Meng-wei

　?。?span lang="EN-US">Department of Gastroenterology General Hospital of Chinese PLA , Beijing 100853;）

　　YOU Wei-di

　　（Department of Gastroenterology General Hospital of Chinese PLA , Beijing 100853;）

　　WANG Hong-fan g

　　（ Institute of Zoology,Chinese Academy of Science, Beijing 100080）

　　FENG Mei-fu

　　（ Institute of Zoology,Chinese Academy of Science, Beijing 100080）

　　ABSTRACT　　Aim: To apply fluorescent mRNA differential display technique.Met hods: Total RNA samples were extracted from human monocyte line U937 treat cd/untreated with IFN and LPS, and were used as templates in differential displa y PCR. The anchored primers used were labeled with the fluorescent tag. After ru nning on 5.6% denaturing PAGE gel, differentially expressed bands were excised a nd recovered, and finally reamplified. Results: Three tested samples all showed amplified bands differed from 300 bp to 2.0 kb, the bands were brigh t and clear, the background was low. Both yes/no changes and upregulated/downreg ulated happenings were shown simultaneously. The reamplification bands were shar p and pure. Conclusion: We have successfully practiced fluorescent differential display technique in our lab. It is a fast, safe and cost-effecti ve method used to sereen unknown expressed genes.

　　KEY WORDS:　differential display;　RNA;　messenger ;　fluorescence

　　mRNA差異顯示技術(shù)（differential display，DD）是用于研究基因的差異表達(dá)的新方法。該技術(shù)自1992年^［1］]被報(bào)道后，即以其不可替代的優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在應(yīng)用過程中不斷得到改進(jìn)^［2］，并產(chǎn)生了諸多衍生技術(shù)如RPA（RNA finger printing by arbitrarily primed PCR）、GDD（genomic DD）等。本文簡要介紹在本試驗(yàn)室熒 光標(biāo)記差異顯示技術(shù)（fluorescent DD，FDD）的應(yīng)用及體會(huì)。

　　1　材料與方法

　　1．1　標(biāo)本

　　人單核細(xì)胞系U937，細(xì)胞密度2×10⁸/L，分對(duì)照組（N）、處理Ⅰ組（T1）、處理Ⅱ組（T 2），N用1640培養(yǎng)基及10％胎牛血清培養(yǎng)，T1用IFN-γ10⁴U/L LPS 1μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0μg/L分別刺激7 h。

　　1．2　主要試劑與儀器

　　TRIzol試劑（GIBCO BRL）、Fluoro DD試劑盒（Genomyx）、Supersript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶（GIBCO 　BRL）、Ampli　Taq DNA聚合酶（GIBCO BRL）、RNase-free DNaseI（Promega）;Genomyx LR 、 Genomyx SC、DNAThermal Cycler（Perkin Elmer）

　　1．3　總RNA的制備

　　按試劑盒提供的方法分別提取三種細(xì)胞的總 RNA，以 RNase-free DNase I（終濃度80 000 U/L）除去其中污染的 DNA，經(jīng)甲醛變性凝膠電冰鑒定其完整性，并以紫外分光光度計(jì)檢 測其純度

　　1．4　mRNA差異顯示

　　1.4．1　逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)　選擇錨定引物［T7（dT₁₂）AP（anchored prime rs，AP），序列為5′ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3′，其中 M＝A／G／C． N＝A /G/C/T］，以總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，每管反應(yīng)體系如下：總RNA l．0μg,AP 4 pmol ,70℃ 5 min,加入50 mmol/L Tris-HCl（pH8.3）,75 mmol/L KCl,3 mmol/L MgCl₂,10mmol /L DTT,25μmol/L，dNTPmix（1∶1∶1∶1），SuperScriptⅡ 60 Units，總反應(yīng)體系20 μl 。42℃ 5 min，50℃ 50 min，70℃ 15 min。

　　1．4．2　熒光標(biāo)記差異顯示PCR　 選取與逆轉(zhuǎn)錄引物序列相同的帶熒光物 質(zhì)標(biāo)記的錨定引物［TMR-T7（dT₁₂）AP］，隨機(jī)引物（5'ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3'），以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括：20 mmol/L Tris-HCl（pH8．4） ，50 mmol/L KCl，3．75 mmol/L MgCl₂，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3．0 μl，50 μ mol/L dNTP mi x（1∶1∶1），0．35 μmol/L 5'-隨機(jī)引物,0．35 μmol/L 3-錨定引物,Ampli Taq 0.5 U nits，總反應(yīng)體系10 μl。95℃ 2 min。94℃　15 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，4個(gè)循環(huán)； 94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

　　1．4．3　分離差異顯示片段　配制5．6％變性聚丙烯酰胺凝膠，膠厚0．2 5 mm，大小61×33 cm。將PCR產(chǎn)物加4．0 μl上樣緩沖液，95℃變性后上樣。3000V、100 W 、55℃電泳4．5 h。干膠后置于Genomyx SC掃描，用系統(tǒng)所帶的AcquireSC program軟件分 析處理掃描結(jié)果。

　　1．4．4　回收差異條帶　用AcquireSC軟件將差異條帶定位，用一次性手 術(shù)刀片切割下所需條帶，置于30 μl去離子水中，37℃水浴30～60 min，備用。

　　1．4．5　差異條帶的再擴(kuò)增　以經(jīng)上述處理的回收條帶為模板，T7啟動(dòng)子 22-mer（5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3'）、反M13（-48）24-mer（5’AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3'）為引物,進(jìn)行再擴(kuò)增反應(yīng)：模板2.0 μl,20 mmol/L Tris-HCl（pH8．4），50 mmol/L KCl，1．5 mmol/L MgCl₂,20 μmol／L dNTP mix（1∶1∶1∶1），0．2 μmol／L T7、0 ．2 μmol/L M13-r，AmpliTaq 1．0 U nits，總反應(yīng)體系20 μl。反應(yīng)條件同差異顯示PC R。

　　2　結(jié)果

　　2．1　總RNA的質(zhì)量

　　總RNA經(jīng)Dnase I處理，用1．0％甲醛變性凝膠電泳，可見清楚的28 S、18 S、5 S條帶 ，且28 S／18 S約為2∶1（圖1），表明RNA完整性好，無降解現(xiàn)象。N、T1、T2的OD260／OD28 0比值分別為1．92、1．83、1．98，表明樣品純度高。

Fig.1 Result of total RNA on formaldehyde-agarosegel

　　2．2　熒光標(biāo)記mRNA差異顯示

　　結(jié)果顯示每一泳道均有約50條大小不等的擴(kuò)增產(chǎn)物，各組間比較見較多呈有無或強(qiáng)弱變 化的差異條帶，圖2中箭頭所示。

Fig.2 Analysis of gene expression of c ells treated

　　with IFN and LPS by differential display technique

　　2．3　差異條帶再擴(kuò)增

　　取T2中約1．25Kb的條帶再擴(kuò)增，結(jié)果見圖3。

Fig.3 Reamplification result of differ entially expressed

　　band DNA marker is 200 bp ladder （200 bp～2 kb）,1.0kb is arro wed

　　3　討論

　　基因表達(dá)是調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為的核心。探討處于不同生理、病理狀態(tài)下的有機(jī)體之間 的未知表達(dá)基因的差異，是研究生命本質(zhì)的有效途徑。1992年報(bào)道的真核細(xì)胞mRNA差異顯示 技術(shù)^［1］，為檢測未知的表達(dá)基因提供了一種新的途徑。DD技術(shù)具有快速、敏感、可同時(shí)檢測兩組或以上的組織或細(xì)胞、RNA用量少、可檢測某一表達(dá)基因的有無或其表達(dá)的 強(qiáng)弱等優(yōu)點(diǎn)，一經(jīng)問世即受到許多領(lǐng)域的重視并得以廣泛應(yīng)用。然而，該技術(shù)也存在著一些缺陷，主要表現(xiàn)為：cDNA產(chǎn)物的質(zhì)量較低，在序列膠中往往呈不清晰狀態(tài)^［2］；所 得的cDNA片段通常小于500 nt，往往是3'-端的非翻譯（編碼）序列；所得差異片段的假陽性 高，可高達(dá)85%^［3］等。

　　熒光標(biāo)記差異顯示技術(shù)通過對(duì)引物設(shè)計(jì)、PCR條件、凝膠、電泳條件以及標(biāo)記物的改進(jìn)，極大減少了上述不足。

　　差異顯示的錨定引物有單堿基錨定引物、簡并或非簡并的雙堿基錨定引物等多種類型，本實(shí)驗(yàn)通過使用雙堿基錨定引物，將總mRNA群體分為12個(gè)亞群，這極大減小了每一錨定引物 產(chǎn)生的*條cDNA鏈的數(shù)量，不僅可降低隨機(jī)引物的用量，更可降低DD產(chǎn)物的復(fù)雜性，使差示條帶在序列膠上易于分辨，從而傳統(tǒng)方法中常見的“重疊帶”現(xiàn)象減少。DD的隨機(jī)引 物的特點(diǎn)為A+T與G+C含量近乎相等，且3’-端以G或C結(jié)尾，可增加DD擴(kuò)增的效率。通過改變RT-PCR反應(yīng)條件如底物濃度、延伸時(shí)間等，差異片段的長度可達(dá)1．0～1．5 kb（圖2）， 因較長的cDNA片段容易通過Northern blot進(jìn)行分析鑒定辨別真假陽性克隆，且其中可提供 更多的序列信息，故獲取大的片段具有重要的意義。

　　文獻(xiàn)認(rèn)為差異顯示居高不下的假陽性率實(shí)際上因再擴(kuò)增所致^［4］。通常，再擴(kuò) 增的引物與DD引物相同，本試驗(yàn)將再擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)為T7（22-mer）與M13-r（24-mer），此為 在錨定引物的5’端和隨機(jī)引物的3'端分別增加的序列（本文方法中所列差異顯示引物序列的 劃線部分），這兩種來源于原核生物的引物盡可能降低了在真核mRNA序列中非特異性擴(kuò)增的 機(jī)會(huì)。同時(shí)，T7啟動(dòng)子序列可直接用于體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA探針，為cDNA片段的直接測序和鑒 定（RPA或Northern分析）提供了方便。

　　用常規(guī)的序列分析膠進(jìn)行分辨時(shí),較長的cDNA片段往往擠在膠的上端而影響分辨率。本操作改用5．6％的PAGE膠（聚丙烯酰胺），減少膠的厚度（僅250 μm），通過提高電泳的電壓（ 3000 V）及溫度（55℃）,可顯著提高分辨率。

　　同位素標(biāo)記存在曝光時(shí)間長、帶型不佳，基本與相鄰的帶混合、污染等缺點(diǎn)，將熒光物 質(zhì)標(biāo)記于錨定引物的5'端,可產(chǎn)生清晰、明亮、低背景的分辨效果，操作周期僅兩天。

　　目前，DD技術(shù)己被廣泛應(yīng)用于與疾病、衰老、生殖、生長發(fā)育、分化等生理^［5］ 、病理過程相關(guān)的未知表達(dá)基因的研究,相信對(duì)揭示生物界基因表達(dá)調(diào)控的奧秘將起重要的作用。

　　*“九五”醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金資助課題（96M145）

　　作者簡介：王剛石（1968-），男，安徽歙縣人，主治醫(yī)師，博士 ，主要從事消化系統(tǒng)疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。

　　4　參考文獻(xiàn)

　　［1］ Liang P， Pardee A B. Differntial display of eukaryotic messenger RNA by means of the Polymerase Chain Reaction ［J］. Science，1992,257:967 -971.

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　　［5］ Cirelli C, Tononi G. Differences in brain gene expresion between sleep and waking as revealed by mRNA differential display and cDNA microarray technolog y［J］. J Sleep Res,1999,8（Suppl）1:44-52.