HPLC法分析*及各類注射劑中有關物質的含量

【資料簡介】

【摘要】  目的 建立一種能用于*原料及制劑中有關物質控制的HPLC方法。方法 采用XBridge Shield RP18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱溫30℃，流動相為乙腈∶pH8.2磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L*溶液，用20%磷酸調節pH至8.2）（55∶45），流速1.0ml/min；檢測波長210nm；樣品溶液的進樣量為200μg。結果 *與其雜質（氮雜*A，*A肟，N去甲基*，*德糖胺以及*N氧化物）能達到基線分離；鹽酸、硫酸、乳糖酸、檸檬酸、馬來酸等*注射劑中常用酸根對*有關物質的測定無影響；方法的線性、準確性、靈敏度以及粗放性均能滿足要求。結論 本文所建方法能較好地反映國產各種*原料及制劑中的有關物質的情況，為國內市場上不同*注射劑的評價、*及其口服制劑的質量控制提供了較好的分析手段。

【關鍵詞】  *； 有關物質； 原料； 制劑

RPHPLC determination of azithromycin and its related substances

    in durg substances and parenteral formulation

    Wang Mingjuan,  Xu Mingzhe,  Hu Changqin,  Wang Lixin  and  Wang Chen

    （National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,  Beijing 100050）

    ABSTRACT  Objective  To develop an HPLC method for determination the related substances of azithromycin in parenteral products.  Method  The separation was performed on a column of XBridge Shield RP18 （250mm×4.6mm, 5μm）, with acetonitrile∶pH8.2 phosphate buffer （0.05mol/L K2HPO4 solution, adjust pH to 8.2 with 20% phosphate acid） （55∶45） as the phase at flow rate of 1.0ml/min. The detection wavelength was 210 nm. The injection amounts of sample solutions were 200μg.  Result Azithromycin and its related substances, including azaerythromycin A, erythromycin A oxime, Ndemethylazithromycin, desosaminylazithromycin and azithromycin Noxide, can be well separated from each other on the developed system. The coexistence acids in azithromycin for injection e.g. HCl, H2SO4, lactobionic acid, maleic acid, citric acid, etc, did not interfere with the determination of the related substances. Linearity, accuracy, sensitivity and robustness of the method could meet the specific analytical requirements.  Conclusion Thedeveloped method can be successfully applied to the quality control of azithromycin drug substances and products.

    KEY WORDS  Azithromycin;  Related substances;  Drug substances;  Drug products

  
　 *為半合成堿性大環內酯類抗生素，由*A生成9肟衍生物后發生Bechman重排，再經還原及N甲基化而成。*在水中幾乎不溶，在稀酸溶液中易溶；對酸較敏感，在酸溶液中可使**降解［1］。中國藥典2005年版中收載有*及其口服制劑，國內新藥試行標準涵蓋了各類注射用*原料（鹽酸*、硫酸*、乳糖酸*、馬來酸*、**、**、*檸檬酸二氫鈉）及相應的注射劑（粉針，小針劑及大輸液）。對上述原料及制劑的科學性評價已勢在必行。

    有關物質檢查是目前藥品安全性評價的一個重要指標。雖然利用TLC可以有效地控制*原料中的有關物質［1］，但HPLC法是zui常用的有關物質檢查方法之一。采用HPLC法分析*有關物質存在以下難點：①與其它大環內酯類抗生素一樣，*在紫外區僅具有末端吸收，限制了其檢測靈敏度；②*屬堿性物質，容易和色譜柱的硅醇基相互作用，導致色譜峰拖尾嚴重。中國藥典2005年版以及國家食品藥品管理局標準中對*原料及其制劑中“有關物質”的檢查均采用薄層色譜法；國外藥典則采用LC末端檢測或電化學檢測法檢查*有關物質（表1）；另有文獻報道［2］，即使采用偏堿性流動相，*及其雜質在普通C18柱或鋁基質色譜柱（USP中的L29色譜柱）中仍拖尾嚴重。新型的雜化顆粒色譜柱XTerra RP18能將*與其雜質較好的分離，該方法已被EP5.0版收載。

    本文參考國外藥典［3～5］和文獻［2］的色譜條件，以*及其主要雜質［氮雜*A（azaerythromycin A，EP中雜質A）、*A肟（erythromycin A oxime）、N去甲基*（Ndemethylazithromycin）、*德糖胺（desosaminylazithromycin）、*N氧化物（azithromycin Noxide），結構示意圖見圖1］的分離情況為指標，建立了一種易在國內普及、專屬性較好的HPLC末端檢測法。該法不僅能滿足對*原料中有關物質的控制，且能較好的排除各種注射用*中各種酸根及其它輔料的干擾，并能滿足對各類*輸液相關物質檢測的靈敏度。采用本方法分析*及各類注射劑中的有關物質含量，為*注射劑的評價提供了科學的 表1        國外藥典中常用*有關物質檢查方法的比較 數據。

    1  材料與方法

    1.1  儀器、試劑與樣品

    島津液相色譜系統：包括LC20AT型雙泵，SIL20AC型自動進樣器，SPDM 20A型PDA檢測器；Waters液相色譜系統：包括1525型雙泵，717plus型自動進樣器以及2487型雙通道紫外檢測器。

    *、磷酸均為分析純級（北京化學試劑廠），乙腈為色譜純級（Fisher公司）。

    *對照品（批號060090QCS）以及氮雜*A、*A肟、N去甲基*、*德糖胺、*N氧化物等雜質對照品均由Pfizer公司提供；*原料（包括鹽酸*、硫酸*、乳糖酸*、馬來酸*、**、**、*檸檬酸二氫鈉）及相應的注射劑（粉針，小針劑及大輸液）均為從流通市場上抽驗到的國內藥廠產品。

    1.2  溶液的制備

    （1）對照品溶液  取*及其雜質對照品，分別精密稱定，用乙腈∶水（60∶40）溶解并分別配制成約0.1mg/ml的溶液，用于有關物質峰定位以及方法學考察。分別精密量取1ml，混勻，作為混合對照品溶液。

    （2）樣品溶液

    ①原料  精密稱取適量，用乙腈∶水（60∶40）溶解（必要時先用乙腈助溶）并稀釋成約10mg/ml（以*計）的溶液；

    ②粉針劑  采用整瓶稀釋法，按標示量用乙腈∶水（60∶40）溶解并稀釋成約10mg/ml的溶液；

    ③水針劑  取5支樣品，混勻后，精密量取適量，用乙腈∶水（60∶40）稀釋成約10mg/ml的溶液；

    ④大輸液  直接進樣測定。

    1.3  色譜條件

    色譜柱：XBridge Shield RP18柱（Waters公司），250mm×4.6mm，5μm；CAPCELL PAK C18UG120（資生堂），150mm×4.6mm，5μm；Apollo C18（Grace公司），250mm×4.6mm，5μm和XTerra MS C18，50mm×4.6mm，2.5μm；柱溫30℃；乙腈∶pH8.2磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L*溶液，用20%磷酸調節pH至8.2）（55∶45）；流速1.0ml/min；檢測波長210nm；進樣量為20μl（大輸液中由于*濃度很低，zui高為2mg/ml，故通過加大進樣體積使總的進樣量為200μg）。

    2  結果

    2.1  HPLC方法的確定

    以*和5種*雜質的分離情況為指標，調整流動相使得*與諸雜質能達到較好的分離，且保持較好的峰形（圖2）。

    本色譜系統對色譜柱有一定的選擇性。*及其雜質在雜化顆粒的C18柱（XBridgeTM Shield RP18和XTerra MS C18）和聚合物包被的C18柱（CAPCELL PAK C18 UG120）中峰形較好， 但在普通耐堿色譜柱*及其雜質混合圖譜（Apollo C18）中峰形不理想，且內嵌極性基團的XBridge Shield RP18柱的選擇性與其它C18柱不同，內嵌極性基團的存在有利于難分離物質對N去甲基*與*德糖胺的分離，建議采用硅膠表面經雜化處理的十八烷基鍵合硅膠色譜柱，如XBridge Shield RP18（250mm×4.6mm，5μm）或與之相當的色譜柱，系統適用性指標采用：①調節流動相比例，使*峰的保留時間約為11min，此時*N氧化物、N去甲基*、*德糖胺、氮雜*A和*A肟相對于*的保留時間分別為0.35、0.48、0.52、0.58和0.62，上述雜質相對于*的校正因子分別為0.62、0.70、1.66、0.77和2.94；②*峰的拖尾因子不得大于2.5；③*對照品溶液在100℃加熱30min后，*與其相鄰降解雜質峰的分離度應符合規定（圖3B）。

    2.2  方法學考察

    按中國藥典2005版附錄XIXA［6］的相關規定，對所建方法的線性、定量限、檢出限、精密性、粗放性和溶液的穩定性進行評價。上述方法檢測*及其雜質的zui低檢出限、zui低定量限、加樣回收率及線性范圍見表2。

    取混合對照品溶液200μl，連續進樣5針，各物質峰面積的RSD均小于0.4%；取不同時間配制的*對照品溶液進樣，其響應值的RSD小于0.5%（n=3）；說明方法的精密性良好。采用島津或者Waters液相色譜系統分析*原料及其制劑中的有關物質，方法的靈敏度、專屬性均能滿足要求。 *：采用有關物質已知的注射用*，利用標準物質加入法（各雜質濃度分別約為0.08、0.10和0.12mg/ml，n=3），考察方法的回收率；

    **：以進樣量200μg計算。冬氨酸、*、檸檬酸二氫鈉等酸根對*有關物質分析的影響，結果表明上述酸根均在接近死體積的位置（RRT約為0.27）出峰，均不干擾有關物質的測定。

    *溶液對酸和熱不穩定，在0.1mol/L鹽酸中放置24h后主峰*消失（圖3A），所形成的雜質經雜質對照品比對及LCMS確認（流動相同本法，但將乙腈∶磷酸鹽緩沖液改為乙酸鹽緩沖液）為其酸降解產物*德糖胺（EP中雜質J）；在100℃加熱30min，雜質也有明顯增加（圖3B），但降解雜質均不干擾對相關物質的測定。

    2.3  對*原料及制劑中有關物質的分析

    在對國產*原料及諸制劑中的有關物質進行分析，發現①*葡萄糖或氯化鈉輸液中的雜質含量zui高；在所檢測的90批樣品中約96%的*輸液中的雜質總量已超過5.0%，個別樣品雜質總量高達46%；約30%的*葡萄糖輸液和10%的*氯化鈉輸液的含量低于其標示量的90%；圖4為*葡萄糖輸液的典型圖譜，該制劑中的zui大雜質為*的酸性降解產物*德糖胺。②各類注射用*原料（鹽酸*、硫酸*、乳糖酸*、馬來酸*、**、*檸檬酸二氫鈉）及其注射劑（包括粉針劑、水針劑）中，雜質總量一般在0.9%～4.0%，但是僅注射用*/*注射液（助溶劑為檸檬酸鈉）和注射用乳糖酸*的部分樣品中的雜質總量能滿足USP30版（2007年增補版）的要求（≤2.0%）。③上述樣品中有關物質的含量與其成鹽或作為助溶劑的酸的性質密切相關：鹽酸*、硫酸*及用磷酸為助溶劑的*注射劑中的總雜質含量均超過3.0%，部分樣品甚至高達10%～20%；采用檸檬酸等弱酸作為助溶劑的注射用*的雜質總量一般小于2.0%。通過比較*在不同酸中的穩定性：放置24h后，*在0.05mol/L硫酸中主峰消失，在0.1mol/L馬來酸中主峰殘留約20%，但在0.1mol/L檸檬酸或0.1mol/L乳糖酸中僅約20%的*發生了降解，提示*注射劑中的雜質主要來源于成鹽/助溶階段。④國產*原料中常見的zui大雜質為氮雜*A、N去甲基*或EP中的雜質B（RRT為1.26～1.29）（圖5）；在所考察的14批原料中僅有14%的樣品雜質總量未超過2.0%，提示國產*原料的質量有待進一步提高。

    3  討論

    本文建立的易在國內普及、專屬性較好的*有關物質HPLC分析方法，較好地解決了*有關物質分析的難題，為*及其口服制劑的質量控制，為科學評價不同酸成鹽/作為助溶劑的各類*注射劑的產品質量均提供了良好的分析手段。

    對各種*注射劑的分析表明，*葡萄糖/氯化鈉輸液中的雜質含量zui高，這與*對酸敏感、對熱不穩定的特性有關，因此，*輸液劑型本身是否合理值得思考。

    注射用*及其水針劑的質量整體好于*輸液，其雜質總量一般在0.9%～4.0%，但其雜質的含量與其成鹽或作為助溶劑的酸的性質密切相關，鹽酸*、硫酸*以及采用磷酸為助溶劑的*注射劑的雜質含量明顯偏高，部分樣品中的雜質總量高達10%～20%，提示科學評價國內市場上含不同酸根的*注射劑劑型的合理性勢在必行。

【參考文獻】
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［6］ 中國藥典委員會. 中華人民共和國藥典2005版（二部）［S］. 北京：化工出版社，2005.

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