抗體不同免疫化學(xué)方法的比較

【資料簡介】

（一）免疫印跡
    在免疫印跡技術(shù)中影響特定抗體效果的三大因素是實驗過程中抗原的變性、在硝酸纖維膜上抗原的呈現(xiàn)和抗體的特異性，這些特點將影響抗體發(fā)揮作用。
    在所有免疫化學(xué)技術(shù)中，抗原結(jié)構(gòu)變化是影響免疫印跡試驗的zui重要因素。在免疫印跡中，任何來源的蛋白質(zhì)都需要在嚴(yán)格條件下進行變性（通常是在2％SDS中煮沸）。通過SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后通過抗體結(jié)合定位。抗原的三維結(jié)構(gòu)在SDS中煮沸時被破壞，  由于硝酸纖維膜的物理附著以及與膜上蛋白結(jié)合的殘留SDS的持續(xù)存在，復(fù)性的可能性不大。因此，用這種方法可以使抗原*變性，只有那些氨基酸線性延伸所形成的表位才有利于抗體的結(jié)合。
           因為免疫印跡實驗較快速，檢測不同的抗體以確定其效應(yīng)比較簡單，容易選擇僅與相應(yīng)抗原及其密切相關(guān)蛋白成員發(fā)生相互作用的良好抗體。必要時，通過仔細(xì)選擇抗體可以區(qū)分相應(yīng)抗原及其密切相關(guān)的蛋白。
（二）免疫沉淀和免疫親和純化
    兩種方法的抗體—抗原相互作用基于相似的物理原理，所以在這里一并討論。兩種方法通常用于收集溶液中的天然抗原，由于表位被破壞，阻礙抗體達(dá)到的空間位阻以及抗體對抗原的親合性等問題使這兩種方法復(fù)雜化。
    因為免疫沉淀和免疫親和純化通常用于收集天然狀態(tài)的蛋白抗原，因此變性常破壞其抗體的識別位點。為使表位的破壞減少到zui低程度，應(yīng)該選擇提取條件以便找到能充分釋放抗原的zui溫和條件。
    這些方法不僅用于待收集的抗原研究，并可用于收集相關(guān)分子。對免疫沉淀尚處于分析階段，而免疫親和純化則已用于大規(guī)模分離。對抗體的評價，應(yīng)以從溶液中去處的總抗原量的部分為依據(jù)。
    （三）細(xì)胞染色和組織染色
    對培養(yǎng)的細(xì)胞或有機體的細(xì)胞染色，選擇有用的抗體極為重要，文獻報道了很多由于抗體選擇不當(dāng)，而得出亞細(xì)胞定位和抗原存在的不準(zhǔn)確結(jié)論。免疫染色的方法學(xué)涉及到抗體的特異性、表位結(jié)構(gòu)的改變以及抗體與抗原結(jié)合的空間位阻問題。
       影響免疫染色成功的一個關(guān)鍵因素是難以確定某一特定抗體的特異性。免疫沉淀或免疫印跡是通過抗原的相對分子量來分離抗原；免疫親和純化方法，其蛋白質(zhì)也常用凝膠電泳來檢測其純度。這為研究人員從非目的的相互作用中區(qū)分有目的的相互作用提供了另一種方法。        

       免疫染色的zui后一個問題是抗體易接近性的空間位阻。這包括靶抗原與其他分子相互作用封閉關(guān)鍵表位的獲取，以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的存在影響抗體充分達(dá)到抗原部位，這些問題是免疫染色方法中所固有的。在設(shè)計實驗和對照組時采用蛋白酶和微波處理可以減少空間位阻，但如何控制其強度，需要在實驗中摸索。