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甘油含量檢測試劑盒說明書
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關 鍵 詞 | 甘油含量檢測 |
- 【資料簡介】
甘油含量檢測試劑盒說明書
描述:甘油是甘油三酯的水解產物。脂蛋白酯酶能水解血液中的甘油三酯;胰脂酶可以水解食 物中的甘油三酯;激素敏感脂肪分解酶能水解脂肪細胞中的甘油三酯。與游離脂肪酸一樣,甘 油含量是甘油三酯水解反應的可靠檢測指標,但檢測更方便。本試劑盒采用甘油氧化酶法 和經典 GPO-Trinder 酶學反應相結合的方法,通過比色法測定液體樣本中的甘油含量。經過優 化后,操作步驟更加簡單,檢測線性范圍在 10-1200µmol/L,可靠性和重復性俱佳,適合生物 醫學、食品實驗室檢測。
參考文獻:
1.Trinder, P. (1969). Ann. Clin. Biochem. 6: 24 – 27.
2.Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97: 142 – 145
原理:在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化為 3-磷酸甘油,再被甘油磷酸氧化酶氧化產生過氧 化氫;在過氧化物酶作用下生色底物轉化為苯醌亞胺,其光密度值與甘油濃度成正比。
適用范圍:測定血液、細胞培養基、體液、酒類飲料中的甘油濃度。
組成 :
R1 試劑 20 ml R2 試劑 5 ml
4 mmol/L 甘油標準品 1 ml
4 ºC,儲存6 個月。
所需設備:酶標儀、生化分析儀或 721、722 型可見光分光光度計。佳工作波長 550nm,如 無此波長建議優先選用 570nm、次選 530、490nm。
操作步驟:
一、樣本處理:
1、 酒類、飲品、清澈液體樣本:可直接進行測定,如超過線性范圍可用蒸餾水或生理鹽水稀釋后 再測定。
2、培養液:取不含酚紅、無顏色、無血清的細胞培養基,如有細胞碎片應 4ºC,,12,000g 離心 5min,取上清進行測定。
3、血液:新鮮抗凝血,4ºC,2,000g 離心 5min 得到血漿;非抗凝血,先 4ºC 靜置 2h 得到血清后, 2000g 離心 10min,除去血細胞。將得到的血漿/血清 70ºC 加熱 10 分鐘滅活內源脂肪酶,12,000g 離心 10min ,取上清測定或-20ºC 保存。
二 、工作溶液配制:按 4:1 比例,取 4 ml 試劑 R1 與 1 ml 試劑 R2 混合,立即使用或 4ºC 保存
<1 天,變色棄去。
三 、標準品稀釋:用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體,將 4 mM 甘油標準品倍比稀 釋為 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 µmol/L,通常取其中 4~6 管即可, 注意設置 0 濃度對照反應管。
四、 甘油濃度測定:
1、參見下表進行加樣。為使反應時間盡量一致,減小實驗誤差,可先加入標準品、待測樣品,然后再加入工作溶液。(注意:當甘油濃度較低時,可將待測樣品與工作溶液按照 100µl:100µl體積混合,然后再進行測定,但是如果樣品體積超過100µl時將會稀釋工作液中酶的濃度,使反應靈敏度下降。如果待測樣品濃度超過線性范圍,可進行適當稀釋,然后根據稀釋倍數來計算樣品中甘油濃度。)
2、37ºC 或 25ºC 反應 15 分鐘。反應平衡后顏色在 60 分鐘定。 3、先用蒸餾水+工作液的空白管調零,然后測定各管 OD 值。
4、繪制標準曲線并計算甘油濃度。
附 Excel 作圖步驟:各標準管 OD 值為 y 軸,標準品濃度為 x 軸。(1)鼠標左鍵圈住數據,點擊做圖向導,選擇-散點圖-,點擊-完成-。(2)鼠標右鍵點圖上的某一點,點擊-添加趨勢線-,點擊-選項-,點擊-顯示公式-和-R2 值-。
表一:
酶標微板測定的加樣比例(檢測范圍 10-1200µmol/L)
(可對樣品和工作液比例進行微量調整)
低濃度甘油樣品測
定
高濃度甘油樣品測定
空白管
標準品
樣本管
空白管
標準品
樣本管
蒸餾水µl
50
5
標準品µl
50
5
樣品µl
50
5
工作液µl
150
150
150
195
195
195
表二:
1 ml 比色杯測定的加樣比例(檢測范圍 10-1200µmol/L)
低濃度甘油樣品測
定
高濃度甘油樣品測定
空白管
標準品
樣本管
空白管
標準品
樣本管
蒸餾水µl
200
50
標準品µl
200
50
樣品µl
200
50
工作液µl
600
600
600
750
750
750
說明:
1、維生素 C>0.18g/L、血紅蛋白>2g/L、膽紅素>0.25g/L、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、高濃度 EDTA干擾測試。
2、正常血清甘油濃度為20-130µmol/L,細胞培養時須用不含酚紅的無色無血清培養基,如果 培養基中含有酚紅,可以選擇含有酚紅的無細胞培養基作為對照進行測定。
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