丙酮酸脫羧酶（PDC）活性測定試劑盒

【資料簡介】

測定意義：

PDC主要存在于酵母中，是乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵酶之一，催化丙酮酸脫羧生成乙醛。

測定原理：

PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛，添加乙醇脫氫酶（ADH）來進一步催化 NADH還原乙醛生成乙醇和NAD⁺；NADH在340 nm有吸收峰，而NAD⁺沒有；通過測定340 nm光吸收下降速率，來計算PDC活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體×1瓶，4℃保存。

試劑四：液體×1瓶，﹣20℃保存。

混合試劑：臨用前配制，小心把試劑四轉(zhuǎn)移到試劑三中，充分溶解。

試劑六：液體×1管，4℃保存。

粗酶液提取：

稱取約0.1g樣品，加試劑一1 mL，冰上充分研磨，16000g 4℃離心20min，取上清液，待測。

PDC測定操作：

1. 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于25℃水浴中預(yù)熱30min以上。

3. 空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸餾水、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六，迅速混勻后于340nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A1和A2。

4. 測定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六，迅速混勻后于340nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A3和A4。

PDC活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1μmol NADH 氧化為1U。

PDC (U/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷(ε×d)×V總×10⁶}÷(Cpr×V樣) ÷T

=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

活性單位定義：25℃中，每克樣品每分鐘催化1μmol NADH 氧化為1U。

PDC (U/g 鮮重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷(ε×d)×V總×10⁶}÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10^-4 L，V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02mL；V樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量試劑盒；W ：樣品質(zhì)量； T：反應(yīng)時間，1 min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1μmol NADH 氧化為1U。

PDC (U/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷(ε×d)×V總×10⁶}÷(Cpr×V樣) ÷T

=3.22×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

活性單位定義：25℃中，每克樣品每分鐘催化1μmol NADH 氧化為1U。

PDC (U/g 鮮重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷(ε×d)×V總×10⁶}÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

=3.22×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10^-4 L，V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02mL；V樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量試劑盒；W ：樣品質(zhì)量； T：反應(yīng)時間，1 min。