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酰基轉移酶(AAT)活性測定試劑盒

2019年11月19日 14:59:33人氣:339來源:南京億迅生物科技有限公司

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關 鍵 詞酰基轉移酶(AAT)活性測定試劑盒
【資料簡介】

測定意義:

AAT是一個多功能蛋白大家族,主要負責催化生物體內各種酰基化和去酰基化反應,在基因表達、代謝和信號傳導中具有重要作用。

測定原理:

AAT催化乙酰CoA轉移乙酰基到丁醇,同時還原DTNB生成TNBTNB412nm有吸收峰,測定412nm吸光度增加速率,來計算AAT活性。

自備儀器和用品:

研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制:

試劑一:液體100 mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體25 mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:粉劑×1管,-20℃保存。臨用前加蒸餾水1mL充分溶解,4℃保存。

試劑四:液體2 mL×1管,4℃保存。

試劑五:粉劑×1管,4℃避光保存。臨用前加入試劑二1mL充分溶解,4℃避光保存。

粗酶液提取:

稱取約0.1g樣品,加試劑一1mL,冰上充分研磨,16000g 4℃離心20min,取上清液待測。

AAT測定操作:

1. 分光光度計預熱30min以上,調節波長到412 nm,蒸餾水調零;水浴鍋35℃預熱。

2. 對照管:依次在500μL EP管中依次加入140μL試劑二、10μL試劑三、20μL試劑四和10μL試劑五,20μL待測液,室溫放置10min后于412nm測定吸光度,記為A1

3. 測定管:依次在500μL EP管中依次加入140μL試劑二、10μL試劑三、20μL試劑四和20μL待測液,35℃水浴15min,加10μL試劑五,室溫放置10min后于412nm測定吸光度,記為A2△A=A2-A1

AAT活性計算:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1)按蛋白濃度計算

AAT活力單位定義:37℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.001個單位為1U

AAT (U/mg prot) = 1000×△A×V÷(Cpr×V) ÷T= 666.7×△A÷Cpr

2按樣本鮮重計算

AAT活力單位定義:37℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化0.001個單位為1U

AAT (U/g 鮮重) = 1000×△A×V÷(V÷V樣總×W) ÷T= 666.7×△A÷W

Cpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,蛋白質濃度需要另外測定;V樣:加入反應體系中上清液體積,0.02mLV總:反應總體積,0.2 mLW 樣品質量;V樣總:提取液體積,1 mLT:反應時間,15min

b.使用96孔板測定的計算公式如下

1)按蛋白濃度計算

AAT活力單位定義:37℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.0005個單位為1U

AAT (U/mg prot) = 2000×△A×V÷(Cpr×V) ÷T=1333.4×△A÷Cpr

2按樣本鮮重計算

AAT活力單位定義:37℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化0.0005個單位為1U

AAT (U/g 鮮重) = 2000×△A×V÷(V÷V樣總×W) ÷T= 1333.4×△A÷W

Cpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,蛋白質濃度需要另外測定;V樣:加入反應體系中上清液體積,0.02mLV總:反應總體積,0.2 mLW 樣品質量;V樣總:提取液體積,1 mLT:反應時間,15min

注意事項:

上清液蛋白質含量需要另外測定。建議購買本公司生產的BCA蛋白質含量測定試劑盒。

南京億迅生物科技有限公司作者

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