腸道病毒71 型B5 亞型（EV71-B5）核酸測定試劑盒說明書

【資料簡介】

腸道病毒71 型B5 亞型（EV71-B5）核酸測定試劑盒

（熒光PCR 法）

Genotype B5 of Enterovirus 71(EV71-B5)Real Time RT-PCR試劑盒

【產品名稱】

通用名稱：腸道病毒71 型B5 亞型核酸測定試劑盒（熒光PCR 法）

英文名稱：Genotype B5 of Enterovirus 71(EV71-B5)Real Time RT-PCR試劑盒

【包裝規格】25 人份／盒

【檢驗原理】 本試劑盒采用聚合酶鏈式反應（PCR）技術結合熒光探針技術，對腸道病毒71 型B5 亞型特異性核酸片段進行熒光PCR檢測。

【預期用途】通過對樣本中腸道病毒 71 型B5 亞型的特異性RNA核酸片段進行定性檢測，可用于臨床對可疑感染患者的病原學鑒別診斷。

【試劑盒主要組成成份】

序號組分 數量體積／人份

1 EV71-B5 核酸熒光PCR 檢測混合液 480ml×1 19ml

2 RT-PCR 酶 28ml×1 1ml

3 DEPC-H2O 400ml×1

4 陽性對照品 30ml×1

說明：不同批號的組分不可以互換使用。

自備試劑：Trizol；lv仿；75%乙醇；異丙醇或磁珠法RNA 提取試劑；本公司可以代為訂購或提供銷售商。

【儲存條件和有效期】試劑盒應在－20℃及以下溫度避光保存，有效期12 個月。采用冰hu加冰或泡沫盒加冰密封進行運輸；熒光PCR檢測混合液反復凍融不宜超過3 次。

【適用儀器】 本試劑盒適用于Slan；PE5700，MJ-Opticon 等單色熒光PCR 儀；ABI7000，ABI7300，ABI7500，ABI7900，MJ-chromo4，MX3000P，MX3005P，SmartCyclerⅡ，Rotor-Gene6000，LightCylerR480，iCycleriQ4，iCycleriQ5 等多色熒光PCR 儀及相應軟件。

【標本要求】

1．上呼吸道感染癥狀（發熱、噴嚏、流涕、咳嗽等）：用滅菌捻拭子拭取鼻腔或咽部分泌物，將分泌物或*置入滅菌試管（含0.4ml 滅菌生理鹽水），用無菌棉球將試管塞緊后，密閉送檢。標本可立即用于檢測，—70 ℃可*保存，標本不宜反復凍融，應采用低溫運送。

2．皰疹性咽峽炎（在咽部、舌、軟腭等處出現小皰疹，可伴有扁桃體腫大）；皮疹（主要分布在面部、手指、足趾等處，為皰疹和斑丘疹。）：用漱口液或無菌捻拭子拭取鼻腔、咽部或病疹分泌物，將分泌物或*置入滅菌試管（含0.4ml滅菌生理鹽水），用無菌棉球將試管塞緊后，密閉送檢。標本可立即用于檢測，—70 ℃可*保存，標本不宜反復凍融，應采用低溫運送。

3．有腦膜腦炎及病毒性心肌炎：用一次性的針筒抽取病人靜脈血2ml，置于滅菌的一次性試管中，取分離出的血清0.2ml 左右送檢。或抽取患者腦脊液0.5 ml，置于滅菌的一次性試管中送檢。

4．糞便：用滅菌捻拭子拭取糞便或腹瀉物置入無菌玻璃管（含0.4ml 滅菌生理鹽水），用無菌棉球將試管塞緊后，密閉送檢。標本可立即用于檢測，—70 ℃可*保存，標本不宜反復凍融，應采用低溫運送。

【檢驗方法】

1. 標本、對照品的核酸裂解處理

（1）用商品化（取得醫療器械許可證）的RNA 提取試劑盒處理標本，具體操作參見該試劑盒說明書。

（2）或用Trizol 法提取，方法如下：取100ml 樣品置于1.5ml 離心管中，加入300ml 裂解液(Trizol)，再加入100ml ， 混勻器上振蕩混勻5sec 或顛倒混勻15 次13000rpm 離心15min， 吸取上層液體，加入等體積異丙醇，顛倒混勻室溫靜置10min，13000rpm 離心10min，輕輕倒去上清；加入700ml 75%乙醇，顛倒洗滌，13000rpm離心5min，輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，棄盡液體或4000rpm離心5sec，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量吸干液體，加入20ml DEPC-H2O 溶解RNA。DEPC-H2O 作為陰性對照。

2.試劑配制取 n×19ml EV71-B5 核酸熒光PCR 檢測混合液與n×1mlRT-PCR 酶(n 為反應管數)，振蕩混勻數秒, 3000rpm 離心數秒。

3. 加樣取上述混合液20ml 置于薄壁PCR 反應管或PCR 反應板中，然后將已處理標本、陽性對照品、DEPC-H2O 各 5ml 分別加入薄壁PCR 反應管或PCR 反應板中，蓋好薄壁PCR 反應管蓋或PCR反應板膜，立即進行PCR 擴增反應。

4. PCR 擴增反應管置于定量熒光 PCR 儀上，*循環參數設置：45℃×10min; 95℃×15min;再按 95℃×15sec→60℃×60sec，循環40 次； 單點熒光檢測在60℃，反應體系為25ml。

熒光通道檢測選擇：選用FAM 通道。

備注：如使用ABI 系列PCR 儀，請務必于passive reference 和quencher 處均選“none”。

5. 基線和閾值設定 基線調整取6-15 個循環的熒光信號，閾值設定原則以閾值線剛好超過DEPC-H2O 的zui高點。

6. 質量控制：試劑盒各對照品須達到以下要求，否則實驗視為無效。Ct 值FAM 通道（目的基因）DEPC-H2O UNDET 或40陽性對照品≤35

7. 試驗結果的判斷

通道Ct 值 結果判斷

1 FAM UNDET 或40 樣本低于檢測限，報告為陰性

2 FAM ≤38 報告為陽性

3 FAM 38～40 復檢一次,如仍為38～40,則報告為陰性

【參考值范圍】陰性（檢測對象EV71 型B5 亞型病毒為病原微生物，在健康人體中不存在）。

【對檢驗結果的解釋】實驗室環境污染，試劑污染，樣品交叉污染會出現假陽性結果；試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性的結果。

【檢驗方法的局限性】當檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于zui低檢測限1×104copies/ml 時可能會發生假陰性的結果。

【產品性能指標】zui低檢測限：1×104copies/ml。

【注意事項】開始檢測前請仔細閱讀本說明書全文。

1. 整個檢測過程應嚴格分在三區進行：PCR 反應體系的配制區；標本處理、加樣區；PCR 擴增、熒光檢測及結果分析區。各區使用的儀器、設備、耗材和工作服應獨立。實驗后即請清潔工作臺，并進行消毒。

2. 使用不含熒光物質的一次性手套(經常替換) 、一次性離心管、自卸式移液器和帶濾嘴吸頭。

3. 試劑準備和標本處理應使用超凈工作臺(負壓式)或防污染罩，以防止對環境污染。

4. 每次實驗應設置陰、陽性對照品。

5. 操作人員應經過專業培訓，具有一定經驗和操作技能。

6. 操作臺、移液器、離心機、PCR 擴增儀等儀器設備應經常用10%次氯酸或75%酒精、紫外線燈或臭氧消毒處理。

7. 實驗中接觸過標準品和對照品的廢棄物品（如吸頭）、擴增完畢的離心管、標本等應進行無害化處理后方可丟棄。

8. 試劑使用前應在常溫下充分融化并混勻。

9. PCR 反應混合液應避光保存。

10. 反應管中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊。

11. 不同批號的試劑請勿混用，請在有效期內使用試劑盒。