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DNA 連接
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關 鍵 詞 | DNA 連接 |
- 【資料簡介】
- DNA分子的體外連接就是在一定條件下, 由DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段組鄰的5’端磷酸與3’端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學過程, DNA分子的連接是在酶切反應獲得同種酶互補序列基礎上進行的。
帶有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必須克隆到具有匹配末端的線性質粒載體中,但是在連接反應時,外源DNA和質粒都可能發生環化,也有可能形成串聯寡聚物。因此,必須仔細調整連接反應中兩個DNA 的濃度,以便使“正確”連接產物的數量達到*水平,此外還常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團以抑制載體DNA的自身環化。利用T4 DNA連接酶進行目的DNA和載體的體外連接反應,也就是在雙鏈DNA 5’磷酸和相鄰的3’羥基之間形成新的共價鍵。如載體的兩條鏈都帶有5’磷酸(未脫磷),可形成4個新的磷酸二酯鍵;如載體DNA已脫磷,則只能形成2個新的磷酸二酯鍵,此時產生的重組DNA帶有兩個單鏈缺口,在導入感受態細胞后可被修復。
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