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重組子的篩選和鑒定

時間:2013-3-26閱讀:2150
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重組子的篩選和鑒定

重組子可通過酶切進行鑒定,也可以利用擴增引物通過 PCR 進行鑒定,陽 性重組子能切出所需要的片段或得到相應片段的 PCR 產物。
1. 用牙簽挑取平板上的菌落接種于 2ml 含適當抗生素的 LB 培養基中,37℃搖 床培養過夜。
2. 次日取菌液 0.2-0.5ml,13,000rpm×3min 離心,棄上清,加入 20μl ddH2 O 和
20μl 酚/氯仿,震蕩混勻,13,000rpm×5min 離心。
3. 取上清進行瓊脂糖電泳,加入載體質粒 DNA 作為陰性對照,根據質粒大小 初步篩選重組子,重組子的泳動速度應該慢于載體質粒。
4. 用堿法小量制備可能是重組子的質粒 DNA。
5. 選取適當的酶,對重組子進行酶切分析,酶切體積均為 10μl 體系。酶切樣品 進行瓊脂糖電泳鑒定是否有所需片段。
6. 酶切析正確的重組子分成兩份,一份進行測序反應,另外一份保種。
7. 若用 PCR 法鑒定,則在第 2 步時每個樣本取 0.5-1.0μl 菌液為模板進行 PCR
反應,每管反應體系zui低可少至 10μl ,PCR 產物電泳,能得到所需條帶的樣 本進一步提取質粒酶切鑒定或送樣品測序。

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