人乙型肝炎病毒 e 抗原(HBeAg)酶聯免疫分析(ELISA)
試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用 目的:本試劑盒用于檢測人血清,血漿及相關 液體樣本中乙型肝炎病毒 e 抗原(HBeAg)水平。
實驗原理:
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯免疫法(ELISA )測定標本中人乙型肝炎病毒 e 抗原 (HBeAg)。用純化的抗體包被微孔板,制成固相抗體,可與樣品中乙型肝炎病毒 e 抗原(HBeAg) 相結合,經洗滌除去未結合的抗體和其他成分后再與 HRP 標記的抗體結合,形成抗體-抗原
-酶標抗體復合物,經過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色, 并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度(OD 值),與 CUTOFF 值相比較,從而判定標本中人乙型肝炎病毒 e 抗原(HBeAg)的存在與否。
試劑盒組成:
試劑盒組成 | 48 孔配置 | 96 孔配置 | 保存 |
說明書 | 1 份 | 1 份 | |
封板膜 | 2 片(48) | 2 片(96) | |
密封袋 | 1 個 | 1 個 | |
酶標包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
陰性對照 | 0.5ml×1 瓶 | 0.5ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
陽性對照 | 0.5ml×1 瓶 | 0.5ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
酶標試劑 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
樣品稀釋液 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑 A 液 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑 B 液 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
終止液 | 3ml×1 瓶 | 6ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
濃縮洗滌液 | (20ml×20 倍)×1 瓶 | (20ml×30 倍)×1 瓶 | 2-8℃保存 |
樣本處理及要求:
1. 血清:室溫血液自然凝固 10-20 分鐘,離心 20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清,保存過程中如出現沉淀,應再次離心。
2. 血漿:應根據標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合 10-20 分鐘后,離心
20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次 離心。
3. 尿液:用無菌管收集,離心 20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清,保存過程 中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心 20 分鐘左右(2000-3000 轉/ 分)。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時,用 PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞 濃度達到 100 萬/ml 左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心 20 分
鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的 PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備 用。標本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清。分裝后一份待 檢測,其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含 NaN3 的樣品,因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
操作步驟:
1. 編號:將樣品對應微孔按序編號,每板應設陰性對照 2 孔、陽性對照 2 孔、空白對照 1
孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)
2. 加樣:分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照 50µl。然后在待測樣品孔先 加樣品稀釋液 40µl,然后再加待測樣品 10µl。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不 觸及孔壁,輕輕晃動混勻,
3. 溫育:用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
4. 配液:將 30(48T 的 20 倍)倍濃縮洗滌液加蒸餾水至 600ml 后備用
5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置 30 秒后棄去,如此 重復 5 次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶標試劑 50µl,空白孔除外。
7. 溫育:操作同 3。
8. 洗滌:操作同 5。
9. 顯色:每孔先加入顯色劑 A 50µl,再加入顯色劑 B 50µl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色
15 分鐘
10. 終止:每孔加終止液 50µl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。
11. 測定:以空白空調零,450nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。 測定應在加終止液后 15 分鐘以內進行。
結果判定:
試驗有效性:陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10
臨界值(CUT OFF)計算:臨界值=陰性對照孔平均值+0.15
陰性判定:樣品 OD 值< 臨界值(CUT OFF)者為乙型肝炎病毒 e 抗原(HBeAg)陰性 陽性判定:樣品 OD 值≥ 臨界值(CUT OFF)者為乙型肝炎病毒 e 抗原(HBeAg)陽性
注意事項
1.操作嚴格按照說明書進行,本試劑不同批號組分不得混用。
2.試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未 用完,板條應裝入密封袋中保存。
3.濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。
4. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
5.底物請避光保存。
6.試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準,使用雙波長檢測時,參考波長為 630nm
7.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。終止液為 2M 的硫酸,使用時必須注意安全。
保存條件及有效期
1.試劑盒保存:;2-8℃。
2.有效期:6 個月
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