1 Taqdna聚合酶

在早期進行的pcr反應中，使用的是大腸桿菌DNA聚合酶1的大片段，，即Klenow片段。也曾有人用噬菌體T4 DNA聚合酶。這兩種酶的共同弱點是對熱不穩定性，DNA合成反應只能在370C進行。PCR時每一循環的解鏈溫度都在90C以上進行，故在每兩個循環之間要加入新的DNA聚合酶，使得整過程整個實驗過程很繁瑣和昂貴。同時在370C，引物與DNA模板之間會發生分子非特異性結合，zui終導致很多非特異性DNA段的擴增。

taq 酶有耐高溫的特性，其zui適的活性溫度是720C(75-80)，連續保溫30分鐘仍具有相當的活性，而且在比較寬的溫度范圍內都保持著催化DNA合成的能力，一次加酶即可滿足PCR操作過程自動化的實現。

(1) TaqDNA聚合酶的熱穩定性及zui適延伸溫度

相對分子質量為94000的TaqDNA聚合酶的酶活性較高，大約為200000Umg，在合成時有一個較高的zui適溫度75-80C，轉換數Kcat接近150nt/(s•酶分子)。這種活性有明顯的溫度依賴性。TaqDNA聚合酶雖然在90C以上合成DNA的能力有限，但高溫時仍比較穩定。有人試驗證明在92.5C,95C,和97.5C時，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分別經130分鐘、40分鐘和5-6分鐘后仍可保持50%左右的活性，其半衰期較長。所以，在一個PCR預備試驗中，每次循環時上限溫度為95C(試管內)處理20秒，則循環50次后TaqDNA聚合酶仍可保持65%的活性，能夠保證實驗的需要。

TaqDNA聚合酶具有很高的加工合成特性，其zui適延伸溫度在75-80C時，dNTP的摻入速度為35-100nt/(•酶分子),zui長延伸長度7。6kb，如對M13上的富含GC的30-me引物，該酶在70C的延伸率高于60nt/(•酶分子), 在55C仍有較高的延伸活性，22C和37C時延伸速度分別為0。25和1。5 nt/(•酶分子)。由此可見，在低溫下，TaqDNA聚合酶一表現活性明顯降低，因而，導致此酶在模板鏈分子內局部二級結構區域的延伸能力受損或前進速率常數與解離常數的比值發生改變。在很高的溫度(90C以上)時，很少DNA合成。在體外條件下，DNA在較高溫度時的合成速度受到引物或引物鏈與模板鏈的雙鏈結構穩定性的限制。溫度對TaqDNA聚合酶活性的影響見表。

由于TaqDNA聚合酶的zui適延伸溫度高達75-80C，故退火和延伸反應溫度均可提高，限制了非特異性擴增產物的出現，增加了PCR的特異性。

2 模板

(1) 模板的純度 一般不要求很高，不需要達到超純。某些擴增實驗中甚至可以直接將溶細胞液煮沸加熱，用蛋白質變性后的DNA溶液作模板。但DNA溶液中不能有影響擴增反應的物質存在，例如蛋白酶、核酸酶、結合DNA的蛋白質等;另一類是尿素、十二烷基硫酸鈉、卟啉類物質等;還有一類是二價金屬離子的絡合劑(如EDTA)等，會與Mg2+絡合，影響Taq DNA聚合酶的活性。上述物質的存在會影響擴增效果，甚至使擴增失敗。

(2) 模板DNA的量 一般對于單拷貝的哺乳動物基因組模板來說，100ul的反應體系中有100ng的模板已足夠。有時，加的模板太多，會令擴增失敗。這時如果對模板稀釋后再加入反應體系中，往往能獲得成功。

3 dNTP

dNTP儲備液必須為PH7.0左右,濃度一般為2mmol/L, 分裝后置-20C保存.典型的PCR擴增體系中,兩種dNTP的終濃度為20-200umol/L. 理論上,100ul反應液中兩種dNTP的濃度為20umol/L時,足以合成12.5ug DNA或合成10pmol 400bp的DNA段. DNTP會絡合溶液中的 Mg2+, 而且大于200umol/L的dNTP會增加Taq DNA聚合酶的錯配率.如果dNTP的濃度達到1mmol/L時,則會抑制Taq DNA聚合酶活性.

4 Mg2+濃度

Taq DNA聚合酶在合成新DNA鏈時,要求有游離的Mg2+,因而在PCR系統中確定Mg2+的zui適濃度是必要的. Mg2+濃度太低會無PCR產物,太高又會導致非特異的產物產生. 故常需根據各自的實驗預先試驗,以確定本實驗的*Mg2+濃度,保證DNA聚合酶具有良好的活性.

通常情況下,要求反應體系中有0.5-2.5mmol/L的游離Mg2+.反應內容物中, dNTP能與Mg2+.結合,所含EDTA會與Mg2+絡合,高濃度的DNA也有干擾作用,都會影響Mg2+的有效濃度.

5 PCR系統中的其它成分

PCR反應緩沖溶液通常用10 mmol/L Tris-HCl(PH8.3, 20C), 它是兩性離子緩沖劑.此外,還有50 mmol/L KCL, 它有利于引物與模板退火.高于50mmol/L 的KCL, 或50mmol/L 的NaCl對Taq DNA聚合酶有抵制作用.明膠或血清白蛋白(100ug/ml)及非離子去污劑,如Tween20等,對Taq DNA聚合酶起穩定作用.

6 PCR的熱循環計劃

在標準反應中,將標本加熱至90-95C,使DNA雙鏈變性, 再快速冷卻至40-60C使引物退火并結合到互補靶序列上,然后升溫至70-75C, 在Taq DNA聚合酶的作用下摻入單核苷酸使引物沿模板延伸.每步時間從反應達到要求溫度后計算. PCR反應的每一個溫度循環周期都是由DNA變性引物退火和反應延伸3個步驟組成的.圖中設定的反應參數是94C變性1分鐘,60C退火1分鐘,72C延伸1.5分鐘.如此周而復始,重復進行,直到擴增產物的數量滿足實驗需求為止.

(1) 變性溫度與時間 使靶基因模板和PCR產物*變性是PCR成敗的關鍵.DNA在其鏈分解溫度時的變性只需幾秒鐘,但反應管內達到Tss還需一定時間,變性溫度太高會影響酶活性;通常情況下94-95C變性1分鐘就足以使模板DNA*變性,更高的溫度可能更為有效(尤其是富含C+G的靶基因),若低于94C,則需延長變性時間.為提高起始模板的變性效果,保存酶活性,常常在加入Taq 酶之前97C先變性7-10分鐘,再按94C的變性溫度進入循環方式,這對PCR的成功有益處.

(2) 復性溫度與時間 復性溫度決定著PCR的特異性.引物復性所需的溫度與時間取決于引物的堿基組成、長度和濃度。合適的復性溫度應低于擴增引物在PCR條件下真實Tm值的5C，引物越短(12-15bp),復性溫度越低(40-45C)。一般來說，若降低復性溫度(37C)，可提高墳增產量，但引物與模板間錯配現象會增多，導致非特異性擴增上升;若提高復性溫度(56-70C)，雖擴增反應的特異性增加，但擴增效果下降。理想的方法是：設置一系列對照反應，以確定擴增反應的zui適復性溫度。

(3)延伸溫度與時間 Taq DNA聚合酶雖能在較寬的溫度范圍內催化DNA的合成，但不合適的溫度仍可對擴增產物的特異性、產量造成影響。引物延伸溫度一般為72C(較復性溫度高10C左右)，延伸時間視目標DNA段長短和濃度而定。在zui適溫度下，核苷酸的摻入率為35-100nt/s，這也取決于緩沖體系、PH值、鹽濃度和DNA模板的性質等，延伸1分鐘對長達2kb的擴增片段是足夠的，延伸時間過長會導致非特異擴增帶的出現，但在循環的zui后一步延伸時，為使反應*，提高產量，可將延伸時間延長4-10分鐘。

(4)循環數 循環數決定著擴增程度，常規PCR一般為25-40周期，在其他參數交已優化的條件下，zui適循環數取決于靶序列的初始濃度，其相應關系參照下表

模板DNA分子數 需要熱循環次數

3.0×105 25-30

1.5×104 30-35

1.0×103 35-40

50 40-45

循環次數太少，得不到一定的產物量;循環次數太多時，擴增反應的后期，產物積累的指數率下降甚至不再有正確的產物生成，正常的反應幾乎停止，呈現平臺效應。

影響出現平臺效應的因素有：

A、反應試劑(dNTP或酶)穩定性的改變;

B、終產物(如焦磷酸)的抑制效應;

C、產物濃度超過10-5時可產生重復退火，于是會降低引物延伸速率或DNA聚合酶的活性

D、高濃度產物DNA雙鏈的解鏈不寶劍。平臺效應時的一種重要后果是由于錯誤引導，在開始時濃度不高的非特異產物會繼續擴增，使結果的分析復雜化。

7引物的要求：

(1) 一般長15-30bp，常用20bp(理論上420=11×1011長的DNA段才會有重復)。引物過長，擴增的效率降低。

(2) 堿基組成：C+G占50-60%(常規)，盡量避免數個嘌呤和嘧啶的連續排列。

(3) 一對引物之間不能有2個以上的堿基互補，特別是3‘末端;引物之間的堿基互補會形成引物二聚體，引物本身應避免回文序列。

(4) 引物與模板退火的溫度和所需的時間取決于引物的堿基組成、長度和溶液中引物的濃度。合適的退火溫度是低于引物本身的實際變性溫度(Tm)50C。20bp左右長度的DNA段的Tm=(G+C) ×40C+(A+T) ×20C。退火火溫度通常在55-720C下進行在標準的引物濃度(0.2umol/L)下，幾秒內即可完成退火。提高退火溫度可提高引物與模板結合的特異性。特別在zui初幾次循環中采用嚴謹的退火溫度，有助于PCR特異性擴增。如果引物中(G+C)的含量小于50%，退火溫度應低于550C。

(5) 100ul的PCR反應液中，引物的量為10-100pmol。PCR反應液中2個引物濃度不等時，其濃度比為50:1，稱為不對稱PCR。

簡并引物：由多種寡核苷酸組成的混合物，彼此之間僅有一個或數個核苷酸的差異。若PCR擴增引物的核苷酸組成順序是根據氨基酸順序推測而來，就需合成簡并引物。

嵌套引物：利用*輪PCR擴增產物作為第二輪PCR擴增的起始材料，同時除使用*輪的一對特異引物外，另加1-2個新引物(處在同一個模板DNA的頭兩個引物之間序列)進行第二輪擴增。通過嵌套引物擴增的產物，產生錯誤擴增的可能性極小，所以應用嵌套引物技術能夠使靶DNA序列得到有效的選擇性擴增。

PCR的的應用：基因克隆、反向PCR、不對稱PCR、RT-PCR、基因的體外誘變和突變檢測、基因組的比較研究。