1、一般培養：保持胚胎干細胞處于未分化狀態

培養基細胞復蘇凍存細胞明膠包被細胞傳代

2 、體外分化

培養基包被有多聚/纖維結合蛋白的培養板（使用或不使用蓋玻片）

體外分化方法

注：以下培養針對于小鼠的R1胚胎干細胞系，其它胚胎干細胞的培養可以參考。不過人的胚胎干細胞培養不可以采用下面的protocol，需要用的protocol和培養基。

一般培養

維持ES細胞處于未分化狀態

ES細胞培養用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed細胞的培養基（高糖）來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1%明膠的平板作為粘附細胞的基質。建議每2-3天從達到80%-90%融合的平板按1：8的比率傳代細胞一次，細胞傳代以后，在將細胞接種在0.1%明膠包被的培養皿之前，通過預先將細胞接種在沒有經過包被的組織培養板2個小時，使分化細胞粘附，從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃，5%CO2，濕度條件下培養。如果在Feed細胞，那么就需要采用MMC進行處理，抑制Feed細胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暫不提及Feed細胞。Feed細胞可以來源于STO細胞或原代胚胎成纖維細胞。

培養基

ES：

配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（該溶液也能用于EB培養基--見下文）。分裝在50ml 離心管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過將21ml該溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制備培養基，0.22 μm濾膜過濾。貯存于4℃，時間不要超過2周。貯存液DMEM（高糖）馬血清（HS）L-（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巰基乙醇（55Mm）PESTLIF

復蘇細胞

細胞被凍存在10%二甲基亞砜（DMSO）中防止結晶的形成，結晶的形成會損害細胞。然而，二甲基亞砜對細胞有毒性，快速的進行細胞復蘇是很重要的。

步驟：1、從液氮中取出一管細胞;2、將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內溶液恰好*溶解）;3、將細胞轉移到一15ml Falcon管中;4、加入5ml ES培養基（用培養基沖洗凍存管）;5、離心3分鐘;6、棄上清，用2ml ES培養基重懸細胞，至少吹打10次;7、接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養皿;8、孵育。

凍存細胞

凍存液：90%HS和10%DMSO

步驟：1、1×PBS洗細胞并留少許PBS在培養皿內;2、用細胞刮刀收集細胞;3、將細胞轉入15ml 離心管管內并離心3分鐘;4、棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中（10 cm的培養皿用2ml，15cm的培養皿用6-7ml。）5、分裝于凍存管內，每管1ml;6、置-80℃過夜，第二天移入液氮。

Geltin（明膠）包被

準備500ml 0.1%geltin溶液1、將0.5 g明膠溶解在500ml無鈣鎂的PBS中（50-65℃水浴15～30分鐘）。2、在溶液沒有冷卻的情況下通過0.22 μm濾膜過濾，貯存在4℃。

包被培養板或培養皿1、加入足量的明膠溶液覆蓋培養平面（15 cm培養皿加2ml，10 cm培養皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能*覆蓋培養表面就行了。）;2、置室溫30分鐘;3、去除明膠溶液，將培養板貯存在包裝袋中室溫放置，將板子平放或倒扣，以免明膠污染蓋子和流出培養板。

細胞傳代

建議每2天傳代細胞一次，過度生長的細胞會降低細胞的自然分化率，我們建立了一種純化方法來去除分化細胞，在將細胞接種在明膠包被的培養板上之前，通過將分化細胞黏附在沒有包被的組織培養板上去除分化細胞。純化步驟包含在下面的方法中。

1、去除培養液;2、無鈣鎂PBS（Gibco）洗滌;3、加入EDTA（Gibco）。37℃孵育5分鐘。4、加入ES。培養基使失活;5、將細胞轉入15 ml離心管中離心3min;6、去除上清，將細胞重懸于2 ml ES培養基，至少吹打10-20次。如果加入培養基的量較少會比較容易將細胞團弄散分開。ES細胞有聚集成團的傾向，傳代過程中仔細將細胞弄散分開很重要。這樣可能會減少細胞的自然分化。7、將細胞接種在沒有包被的組織培養皿中（使用和一開始同樣規格的培養皿）放入溫箱2小時（分化細胞在該時間內將黏附，而ES細胞仍將保持懸浮）;8、將含有細胞的培養基轉入geltin包被的組織培養皿。吹打以確保細胞被分散開（前面已經提到--ES細胞有聚集成團的傾向）9、建議按1：4-1：10的比率傳代 （ATCC）

保持細胞的傳代比率很重要，以我們的經驗，1：8的比率是好的，可以使細胞的自然分化降到zui低。當你使用不同規格的培養板進行細胞傳代可以使用表1來計算傳代比率。