樣品制備原則

樣品制備是雙向電泳中zui關(guān)鍵的一步，將直接影響 2-DE 結(jié)果好壞。目前并 沒有一個(gè)通用的樣品制備方法，盡管處理方法多種多樣，但都遵循幾個(gè)基本的原則：1. 盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提zui大量的總蛋白，減少蛋白質(zhì)的 損失;2. 減少對(duì)蛋白質(zhì)的人為修飾;3. 破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作 用，并使蛋白質(zhì)處于*變性狀態(tài)。

根據(jù)這一原則，樣品制備需要四種主要的試劑：離液劑（chaotropes）,主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）;表面活性劑（sufactants），也稱去垢劑， 如 CHAPS 與 Zwittergent 系列等雙性離子去垢劑;還原劑（reducing agents），zui常用的是二硫蘇糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP）等。當(dāng)然，也可以選擇性 的加入 Tris-base,蛋白酶抑制劑以及核酸酶。

樣品的來源不同，其裂解的緩沖液也各不相同。通過不同試劑的合理組合， 以達(dá)到對(duì)樣品蛋白的zui大抽提。在對(duì)樣品蛋白質(zhì)提取的過程中，必須考慮到去除 影響蛋白質(zhì)可溶性和 2DE 重復(fù)性的物質(zhì)，比如核酸、脂、多糖等大分子以及鹽 類小分子。大分子的存在會(huì)阻塞凝膠孔徑，鹽濃度過高會(huì)降低等電聚焦的電壓， 甚至?xí)p壞 IPG 膠條，這樣都會(huì)造成 2-DE 的失敗。樣品制備的失敗很難通過后 續(xù)工作的完善或改進(jìn)獲得補(bǔ)償。

核酸的去除可采用超聲或核酸酶處理，超聲處理應(yīng)控制好條件，并防止產(chǎn)生 泡沫;而加入的外源核酸酶則會(huì)出現(xiàn)在zui終的2D 膠上。脂類和多糖都可以通過 超速離心除去。透析可以降低鹽濃度，但時(shí)間太長(zhǎng);也可以采取凝膠過濾或沉淀 / 重懸法脫鹽，但會(huì)造成蛋白質(zhì)的部分損失。

因此，樣品制備方法必須根據(jù)不同的樣品、所處的狀態(tài)以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?來進(jìn)行選擇。目前有很多方法適于 2-DE，如組織或細(xì)胞的總蛋白提取物、亞細(xì) 胞組份或細(xì)胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亞組份蛋白（如磷酸化蛋白、采用 親合純化凝集素結(jié)合蛋白等）。

一、細(xì)胞樣品

1. 細(xì)胞培養(yǎng)，加藥與處理。

2. 消化貼壁細(xì)胞，PBS 漂洗 3 次（1500g，5min），棄上清，再次離心，去盡殘液（非常重要!） 。如要比較細(xì)胞膜蛋白組的差別，用細(xì)胞刮收細(xì)獲胞。如用 10mMTris/250 mMSucrose（pH7.0）代替 PBS，可有效降低樣品的鹽濃度。加入5倍體積裂解液，混勻（或?qū)?1×106 細(xì)胞懸于 60～100μl 裂解液中） 。

3. 加 50ug/mlRNase 及 200ug/mlDnase，在 4℃放置 15 分鐘。

4. 15,000 轉(zhuǎn)，4℃離心 60 分鐘（或 40,000 轉(zhuǎn)，4℃離心 30 分鐘） 。

5. 收集上清。

6. 測(cè)定蛋白濃度（ 采用 BioRadRC/DCprotein assaykit）。

7. 分裝樣品，凍存于-70℃。

二、組織樣品

1. 碾缽碾磨組織，碾至粉末狀。

2. 將適量粉末狀組織轉(zhuǎn)移至勻漿器，加入適量裂解液，進(jìn)行勻漿。

3. 加 50ug/mlRNase 及 200ug/mlDNase，在 4℃放置 15 分鐘。

4. 15,000 轉(zhuǎn)，4℃離心 60 分鐘（或 40,000 轉(zhuǎn)，4℃離心 30 分鐘） 。

5. 收集上清，測(cè)定蛋白濃度。

6. 分裝樣品，凍存于-70℃。

注意事項(xiàng)：

1. 8 mmol/L PMSF 必須在添加還原劑之前用，否則 PMSF 會(huì)失去活性。

2. 40 mmol/L 濃度以下的 Tris可使有些蛋白酶在高 pH 值下失活。

3. 細(xì)胞清洗――大多用 PBS， 若PBS 殘留于細(xì)胞表面會(huì)造成膠上出現(xiàn)水平條紋，則可利用（10 mmol/L Tris,250 mmol/L sucrosepH 7.0）來解決此問題。