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PCR反應體系內部因素

2025-5-6  閱讀(17)

  一個PCR反應過程分為很多的步驟,包括樣本采集,運輸,核酸提取,qpcr擴增等步驟,因此結果會受到很多因素的影響,本文將常見因素分為內部因素和外部因素,內部因素是指正常試劑體系中的成分,外部因素是指環境或者樣本帶入的因素。
 
  體系內部因素:
 
  1、引物:長度、擴增跨度、特異性等因素;
 
  2、酶及其濃度:酶濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產物量減少;
 
  3、dNTP的質量與濃度:dNTP溶液呈酸性,一般配置成體系需將其調節至7.0-7.5,正常情況下4種dNTP的濃度應該相等,如果其中某一種過高就會引起錯配,濃度過低又會引起PCR產物的產量。不過目前使用的都是商品化配置好的預混液體系;
 
  4、模板核酸:模板核酸的量和純度,是PCR成敗與否的關鍵環節之一,對于RNA模板更要注意RNA的降解;
 
  5、Mg2+濃度:主要影響PCR擴增的特異性和產量,Mg2+濃度過高,反應特異性降低,出現非特異性擴增,濃度過低會降低Taq 酶的活性,使反應產物減少;
 
  6、溫度與時間的設置:變性溫度與時間、退火溫度與時間、延伸溫度與時間;
 
  7、循環次數:循環次數決定PCR擴增程度,PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。一般溫度循環次數在30-40次之間,循環次數越多,非特異性產物的量就越多。
 


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