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模板核酸蛋白酶K消化裂解法的提取制備方法

2024-1-15  閱讀(130)

模板核酸蛋蛋白酶K消化裂解法適用于所有標本的消化處理,尤以DNA樣品為佳。如組 織細胞(包括石蠟包埋組織)絨毛、毛發(fā)、精斑、血液(血清、血漿、全血)局部分泌 物、尿,糞便等。


1、試劑配制

1)蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)

10mmol/LEDTA

150mmol/LNaCL

0.5%SDS

100~200ug/ml蛋白酶K.

2)蛋白酶K最好用水配成20mg/ml,臨用時加入消化液中。


2、提取方法:

有些標本、在用蛋白酶K消化前,還需預處理一下,如糞便、分泌物、痰液、組 織塊、石蠟包埋組織等,其方法有離心去掉雜質(zhì),脫蠟等。

臨床標本或經(jīng)預處理的標本加蛋白酶K裂解液50~100ul.混勻,55℃1~3小時, 或37℃過夜。加等體積的飽和酚抽提1~2次,再加等體積的氯仿:異戊醇(49:1)抽提一 次,上清加入1/10體積的pH值5.23mmol/L醋酸鈉緩沖液,加入2.5倍體積的冰冷無水 乙醇(或加等體積的異丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000轉(zhuǎn)/min離心15min.小心吸 棄或倒出上清,沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min離心洗滌1~2次,特別小心的 吸棄或倒掉上清,真空或37℃溫箱或室溫干燥,加TE緩沖液20ul.溶解后,取3~8ul 用于PCR擴增,或放-20℃保存。

蛋白酶K消化法除上述經(jīng)典處理法外,亦可在蛋白K消化處理標本,經(jīng)離心處理 后,吸取上清經(jīng)95~97℃或煮沸10min滅活蛋白酶K后,直接作核酸模板用于PCR擴增。 如雜質(zhì)較多,還可經(jīng)酚:氯仿抽提后,即可用于PCR反應。此法蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)消除掉,Taq酶活性不受影響,具有良好的重復性與穩(wěn)定性。但操作繁復,技術(shù)要求高。




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