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詳解PCR引物設(shè)計原則
2022-7-5 閱讀(2448)
PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計引物時以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。
PCR 引物設(shè)計基本原則：
1）、引物長度：18-26bp，可放寬至18-30bp（有研究表明超過30bp再增加引物長度意義不大）；
2）、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在；
3）、引物Tm：54-58℃，可放寬至52～62℃，GC%>60%可進一步放寬；
4）、擴增子Tm：>92℃；
5）、3'端：優(yōu)選三聯(lián)體WSS、SWS、TTS，二連體GC，單體S，盡量規(guī)避WWW、CGW、GGG、CG；
6)、引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有*互補序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴增；
7）、末端2bp最好為GC；
8）、引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物su、熒光物質(zhì)、de高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等；
9）、其他：避免3'端8bp及以上序列與模板多位點互補，盡量避免上下游3'端4bp及以上反向互補，盡量避免內(nèi)部回文。
基于上述原則，實踐中兩種應(yīng)用情況：
1、基因克隆PCR引物設(shè)計
這種情況我們往往并沒有太多選擇，只能從ATG開始，從TAA等結(jié)束，什么GC%、二聚體和錯配，可能根本由不得我們。既然起點定了，那只能通過改變長度來匹配*優(yōu)設(shè)計要求了。
2、鑒定PCR引物設(shè)計
我們只需要確認(rèn)一段DNA序列上的一部分，起點是相對的，我們可以在整個序列范圍內(nèi)搜索，引物設(shè)計的靈活性大大提高，當(dāng)然搜索時間也要增加。
