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詳解PCR引物設(shè)計原則

2022-7-5  閱讀(2448)

PCR反應(yīng)中有兩條引物,即5′端引物和3′引物。設(shè)計引物時以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)(常以信息鏈為基準(zhǔn)),5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

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引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。

PCR 引物設(shè)計基本原則:

1)、引物長度:18-26bp,可放寬至18-30bp(有研究表明超過30bp再增加引物長度意義不大);

2)、引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在;

3)、引物Tm:54-58℃,可放寬至52~62℃,GC%>60%可進一步放寬;

4)、擴增子Tm:>92℃;

5)、3'端:優(yōu)選三聯(lián)體WSS、SWS、TTS,二連體GC,單體S,盡量規(guī)避WWW、CGW、GGG、CG;

6)、引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%,引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有*互補序列,否則易導(dǎo)致非特異性擴增;

7)、末端2bp最好為GC;

8)、引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點,引入突變位點,用生物su、熒光物質(zhì)、de高辛標(biāo)記,加入其它短序列,包括起始密碼子、終止密碼子等;

9)、其他:避免3'端8bp及以上序列與模板多位點互補,盡量避免上下游3'端4bp及以上反向互補,盡量避免內(nèi)部回文。

基于上述原則,實踐中兩種應(yīng)用情況:

1、基因克隆PCR引物設(shè)計

這種情況我們往往并沒有太多選擇,只能從ATG開始,從TAA等結(jié)束,什么GC%、二聚體和錯配,可能根本由不得我們。既然起點定了,那只能通過改變長度來匹配*優(yōu)設(shè)計要求了。

2、鑒定PCR引物設(shè)計

我們只需要確認(rèn)一段DNA序列上的一部分,起點是相對的,我們可以在整個序列范圍內(nèi)搜索,引物設(shè)計的靈活性大大提高,當(dāng)然搜索時間也要增加。








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