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閱讀：500發(fā)布時(shí)間：2017-6-23
細(xì)胞培養(yǎng)面面觀
1、首先說(shuō)清洗：對(duì)于玻璃器皿（如移液管、蓋玻片之類(lèi)）可先用酸液浸泡24h以上，再用清水浸泡24h。之后用清水將移液管沖洗10遍，除去殘留酸液，再用雙蒸水沖洗3-5遍，*洗凈后放入不銹鋼筒中，雙層牛皮紙?jiān)冢邏簻缇?0min，烘干待用。我們實(shí)驗(yàn)室的酸液一般是次強(qiáng)酸液（重鉻酸鉀120g 濃硫酸200 mL 蒸餾水1 000 mL）配液時(shí)要小心燙傷。裝培養(yǎng)基的瓶子則要在每次用完培養(yǎng)基以后就要立即洗凈，臨用時(shí)再次用清水沖洗3-5遍，再用雙蒸水漂洗3次，洗凈后瓶口蓋上錫箔紙，外包雙層牛皮紙?jiān)诤蟾邏簻缇?0min，與其配套的瓶蓋則洗凈后另行包好同時(shí)滅菌、烘干。培養(yǎng)基過(guò)濾器滅菌同瓶子，也要在用完后及時(shí)洗凈、滅菌時(shí)保持密封。Tip頭就容易了，插到盒子里，雙層牛皮紙包好后直接高壓滅菌就好了。
2、再說(shuō)說(shuō)除菌：我說(shuō)的除菌主要是指溶液的除菌。如PBS、HEPES之類(lèi)的一些緩沖劑和不含葡萄糖的鹽溶液，可以配好以后直接高壓滅菌。而大部分的溶液由于成分限制必須過(guò)濾除菌。我們實(shí)驗(yàn)室需要過(guò)濾除菌的溶液有：膠原酶、胰酶、各類(lèi)血清、抗生素、G-418溶液、各類(lèi)培養(yǎng)基、各類(lèi)生長(zhǎng)因子、丙酮酸鈉、谷氨酰胺等。
3、關(guān)于各類(lèi)溶液的配制：我列出我們實(shí)驗(yàn)室常用試劑的配方
1XPBS：氯化鈉8克、0.2克、磷酸二氫鈉1.15克、磷酸氫二鉀0.2克，加水至一升，調(diào)pH=7.4。這里我認(rèn)為PBS的pH是zui重要的一環(huán)，不可大意。
HEPES溶液：8克氯化鈉、0.3克、0.135克磷酸氫二鈉、1克葡萄糖、5克HEPES加水900ml，調(diào)pH=7.4
抗生素：我們主要用青霉素和鏈霉素，一般用1XPBS稀釋至1X105單位，-20度儲(chǔ)存，用時(shí)直接加入培養(yǎng)基，工作濃度一般為1X102單位。
G-418：1克包裝的G-418瓶中加入10mlHEPES溶液*溶解，過(guò)濾除菌后分裝于EP管，-20度保存。
谷氨酰胺：L-谷氨酰胺29.2克，加Hanks‘BBS1000ml溶解，配成200mmol/L過(guò)濾除菌，4度保存，工作濃度1～4mmol/L。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來(lái)的谷氨酰胺。
1XEDTA-胰酶：0.25克胰酶加0.1克EDTA*溶解于500ml 1XPBS中，過(guò)濾除菌后分裝于50ml離心管中，一管4度備用，其他-20度保存。我不太主張配成10X的母液，因?yàn)橐让阜磸?fù)凍融后，效果會(huì)差很多。（EDTA很難溶，必要時(shí)候可放置過(guò)夜）
MTT：sigma公司出產(chǎn)，用1XPBS配成50mg/ml待用。MTT毒性很大，配置時(shí)務(wù)必小心。
各類(lèi)培養(yǎng)基：現(xiàn)在我們實(shí)驗(yàn)室都是買(mǎi)GIBICO的粉劑自己配制。包裝盒上會(huì)有配制方法，以及加碳酸氫鈉的量。按說(shuō)明來(lái)就是了。需要注意的是在配培養(yǎng)基前，先確保碳酸氫鈉充分溶解，避免局部pH偏高或偏低。SmileSmile
再一個(gè)就是水的使用，一般配鹽溶液，用三蒸水即可，而配制培養(yǎng)基務(wù)*超純水，并在使用前要高壓滅菌。
4、關(guān)于培養(yǎng)基的選用：我養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞株不多，權(quán)當(dāng)拋磚引玉吧。
一般來(lái)說(shuō)大部分細(xì)胞系我們都用高糖DMEM+10%FCS培養(yǎng)，我們實(shí)驗(yàn)室用該培養(yǎng)基的有：HepG-2、NIH-3T3、A549、Hela、C2C12、COS-7。特殊的，如P19Cl6用α-MEM+10%FCS，SGC-7901用RPMI-1640+10%FCS，293細(xì)胞則用MEM+熱滅活的馬血清。
對(duì)于貼壁不是很緊的細(xì)胞，用45%DMEM+45%α-MEM+10%FCS有奇效~
5、操作中的一些小細(xì)節(jié)
實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)以紫外燈照射30分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)數(shù)分鐘后，才開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)5分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。
無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無(wú)菌區(qū)域，勿在邊緣之非無(wú)菌區(qū)域操作。
小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開(kāi)之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
定期檢測(cè)下列項(xiàng)目： CO2 鋼瓶之CO2 壓力 、CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤(pán)是否有污染(水盤(pán)的水用無(wú)菌水，每周更換)、無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過(guò)濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)、液氮罐中的液氮高度。 水槽可添加飽和硫酸銅溶液，并定期換水。
6、血清的相關(guān)問(wèn)題
血清必須貯存于–20℃，若存放于4℃，不要超過(guò)一個(gè)月。如果一次無(wú)法用完一 瓶，可將40～45 ml 分裝于無(wú)菌50 ml 離心管中，預(yù)留此膨脹體積之空間，以免容器凍裂。
一般廠商提供之血清為無(wú)菌，不需再無(wú)菌過(guò)濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾，勿直接過(guò)濾血清。
瓶裝(500ml) 血清一定要逐步解凍: 4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，在溶解過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。
熱滅活是指56℃, 30 分鐘加熱已*解凍之血清。加熱過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份 去活化。除非必須，一般不要作此熱處理，因?yàn)闀?huì)造成沉淀物之顯著增多，且會(huì)影響血清之品質(zhì)。以我們實(shí)驗(yàn)室做的對(duì)照試驗(yàn)看，未滅活血清效果的確要好些。
7、貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng) ：一般步驟為：真空泵吸走培養(yǎng)基，1XPBS漂洗兩次，加入1mlEDTA-Tripsin（100mm皿為例），37度放置數(shù)分鐘，輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量血清，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，離心后加入新鮮培養(yǎng)基，按比例轉(zhuǎn)移至新皿。
細(xì)胞的傳代zui重要的是胰酶處理時(shí)間，若胰酶處理太久，容易造成細(xì)胞貼壁不緊，顯微鏡下觀察立體感不強(qiáng)，嚴(yán)重的時(shí)候甚至?xí)斐杉?xì)胞死亡。我談?wù)剛€(gè)人經(jīng)驗(yàn)：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901幾種癌細(xì)胞處理時(shí)間可適當(dāng)放長(zhǎng)，一般處理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比較容易脫落，2min足矣，P19Cl6和293細(xì)胞貼壁不緊，可在PBS漂洗后，直接換新鮮培養(yǎng)基打散。
8、細(xì)胞凍存及復(fù)蘇 ：
首先說(shuō)凍存液配方，常用的配方一般是兩種——90%FCS+10%DMSO或70%培養(yǎng)基+20%FCS+10%DMSO。前一種較貴，而且后一種凍存效果也不錯(cuò)，因此本人一般選用第二種配方。對(duì)于比較脆弱的細(xì)胞則選用前一種凍存液。
凍存步驟比較簡(jiǎn)單，前期處理同細(xì)胞傳代，只是在離心后是直接吸取上清，用手拍打離心管底部，加入適量?jī)龃嬉菏辜?xì)胞*懸浮后分裝于凍存管。制后先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。 接著置于-20℃冰箱，約60min。置于-80超低溫冰箱中放置過(guò)夜。 zui后置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。 同時(shí)做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。
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