200．蘇州華宇凈化工作臺在柑橘類果汁中檸檬苦素的含量及其性質研究中的應用實踐經驗

1 材料與方法          

1.1 主要儀器與材料

SW-CJ-IF 凈化工作臺：蘇州市華宇凈化設備有限公司；電熱恒溫培養箱：湖北省黃石市恒豐醫療器械有限公司；高壓滅菌鍋：上海醫用核子儀器有限公司；JA1003N 分析天平：上海精密科學儀器有限公司；Model680 全自動酶標分析儀：BIO-RAD 公司；CO2 培養箱：SANYO 公司；SW-CJ-IF 凈化工作臺：蘇州市華宇凈化設備有限公司；96 孔細胞培養板：海門市天龍實驗器。檸檬苦素：由本實驗室按照文獻[3]制備；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）As1.140：購于中國科學院微生物研究所；細胞株：人胃癌細胞SGC7901，購于上海細胞生物研究所；二甲亞砜：購于AMRESCO 公司。噻唑藍（MTT）：AMRESCO0793 產品；RPMI1640 培養液：Hyclone 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 果汁中檸檬苦素含量的測定參考文獻[3]進行。

1.2.2 檸檬苦素的抗氧化活性

采用豬油自由基體系中豬油過氧化值（POV）表示。在新鮮豬油中按不同添加量添加檸檬苦素（0.1、0.2、0.4、0.8 g/kg）及BHT（0.2 g/kg）,置于70 ℃恒溫烘箱中，測定豬油過氧化值（POV）的變化情況[4]。

1.2.3 檸檬苦素的抑菌活性

牛津杯瓊脂擴散法，參考文獻[5]進行。取處于不同生長時期的枯草芽孢桿菌涂布平板，放置牛津杯，培養24 h 后測量抑菌圈直徑大小。檸檬苦素濃度為0.5 g/L，以溶解檸檬苦素的二氯甲烷溶液為空白對照。

1.2.4 檸檬苦素的抗腫瘤活性

通過細胞生長抑制試驗（MTT 法）測定。

檸檬苦素溶液的制備：檸檬苦素溶解于二甲亞砜（DMSO）中，配成10 g/L 儲存于0 ℃備用。臨用前用培養液配成100 mg/L，4 倍遞減稀釋。細胞株培養：人胃癌細胞SGC7901 接種在含10 %胎牛血清的RPMI1640 培養液中，置于CO2 培養箱內，37 ℃，5 % CO2 及飽和濕度條件下培養。細胞生長抑制效應的測定：選對數生長期細胞，用0.25 %的胰蛋白酶消化，0.01 mol/L PBS pH7.4 洗2 次，以108 個/L~1011 個/L 的濃度接種于96 孔板中，每孔150 μL。培養24 h 后試驗組依次加入新配制的含不同濃度檸檬苦素的培養基20 μL，終濃度為4、20、100 g/L，每個濃度3 個復孔，同時用含DMSO 的*培養基作對照。每天取一培養板加入20 μL MTT（終濃度0.25 g/L），37℃繼續培養4 h 后小心吸去培養液，每孔加入150 μLDMSO，振蕩器振蕩10 min，使結晶物充分溶解。選擇570 nm 波長在自動酶標分析儀上測各孔的光吸收值。存活率/%=（試驗組測定的平均A 值/對照組測定的平均A 值）×100