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上海莼試生物技術(shù)有限公司
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雙熒光素酶報告基因試驗

時間:2016/2/3閱讀:534
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    基本原理:實驗所用報告基因載體為pFR-Luc編碼螢火蟲(Firefly)熒光素酶。為了消除每個孔轉(zhuǎn)染效率不同的影響,實驗時共轉(zhuǎn)pRL-TK作為內(nèi)對照,該質(zhì)粒編碼海腎(Renila)熒光素酶。這兩種熒光素酶的底物和反應(yīng)緩沖液不同,所以可以用同一樣品在同一個試管中測定。實驗時,首先加入LARⅡ,測量Firefly熒光素酶活性,然后加入Stop&GloReagent,消除Firefly熒光素酶活性,同時激發(fā)Renila熒光素酶的活性并測量。這兩種試劑均由試劑盒提供。zui終結(jié)果取Firefly與Renila熒光素酶讀數(shù)的比值獲得相對熒光值(RLU)。細胞

(1)準(zhǔn)備反應(yīng)溶液

1)PLB(PASIVELYSISBUFFER):使用前將5×PLB用無菌的蒸餾水稀釋至1×,一般用24孔板,每孔80μl;

2)LARⅡ(LuciferaseAsayReagentⅡ):在熒光素酶底物中加入10mlBufer,混勻(1ml分裝),-70℃存放;

3)Stop&GloReagent:將20μl底物以20μl分裝(進口小管),存放于-70℃冰箱。使用時加入到1ml分裝的緩沖液中即可。

(2)裂解細胞

1)4-48h后收取細胞,吸除培養(yǎng)基,用1×PBS輕柔洗2遍后,加入1×PLB反應(yīng)液80-10μl(需*浸沒細胞)。每3耀5min搖晃1次,室溫15min;

2)將裂解液轉(zhuǎn)移至無菌小管,120rpm離心30s,取上清轉(zhuǎn)移至新的無菌小管。測量應(yīng)該在2h內(nèi)進行,如果需要可儲存在-70℃冰箱中,但要注意每次凍融約有50%的熒光素酶活性丟失。

(3)測量熒光素酶活性

1)預(yù)熱熒光計,設(shè)定參數(shù),每次延遲2s后開始測定,測定時間為10s。用空的一次性測量管進行調(diào)零。

2)將40μlLARⅡ加入一次性測量管中;

3)將10μl細胞裂解液加入其中,混勻,放入熒光劑開始測量,記錄Firefly熒光素酶讀數(shù);

4)加入40μlStop&GloReagent,混勻,放入熒光劑開始測量,記錄Renila熒光素酶讀數(shù);繼續(xù)測量其他樣品。

5)計算Firefly與Renila熒光素酶讀數(shù)的比值,取3個平行孔的平均值,并計算標(biāo)準(zhǔn)差。

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