1．材料

① 免疫 血清60℃滅活20分鐘，用Kolmers鹽水作2倍稀釋成1:2、1:4、1:8或更高。如免疫血清補(bǔ)體結(jié)合的效價(jià)為1:32，則免疫血清應(yīng)作1:8稀釋。Kolmers鹽水配制：在pH 7.4，0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中溶解MgSO4 ，含量為0.01%；

② 補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清，一般作1:10稀釋或按補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試管法所測(cè)定的結(jié)果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用；

③ 抗補(bǔ)體熒光抗體：在免疫血清效價(jià)為1:4，補(bǔ)體為2單位的條件下，用補(bǔ)體染色法測(cè)定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價(jià)，然后按染色效價(jià)1:4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。

2．操作步驟

① 涂片或切片固定；

② 吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清與補(bǔ)體等量混合液(此時(shí)免疫血清及補(bǔ)體均稀釋1倍)滴于切片上，置于濕盒內(nèi)，37℃孵育30分鐘；

③ 用緩沖鹽水振蕩洗滌2次，每次5分鐘，吸干標(biāo)本周圍水液；

④ 滴加經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的抗補(bǔ)體熒光抗體，37℃孵育30分鐘，水洗同上；

⑤ 蒸餾水洗1分鐘，甘油緩沖液封固。抗體

3．對(duì)照實(shí)驗(yàn)染色過(guò)程應(yīng)設(shè)立對(duì)照實(shí)驗(yàn)，包括：

① 抗原對(duì)照；

② 抗血清對(duì)照：用正常兔血清代替免疫血清；

③ 滅活補(bǔ)體對(duì)照：將補(bǔ)體經(jīng)56℃ 30分鐘處理后，按補(bǔ)體同樣比例稀釋，與免疫血清等量混合后，進(jìn)行補(bǔ)體法染色。

此法的熒光抗體不受免疫血清的動(dòng)物種屬限制，故一種熒光抗體的應(yīng)用可更廣泛，敏感性亦較間接法高，效價(jià)低的免疫血清亦可應(yīng)用，故可節(jié)省免疫血清，尤其是在檢查形態(tài)小的立克次體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原時(shí)，使用此法甚為理想。