揭示如何對比較弱的優(yōu)化蛋白相互作用進行研究

    生物體中有時執(zhí)行細胞功能的是一些表達量低，與其它蛋白相互作用弱的蛋白質(zhì)，要對這些相互作用進行分析，Y2H常常不能奏效——酵母雙雜是在體內(nèi)進行分析，因此對于一些低豐度，蛋白相互作用弱的關系就不能準確的描繪，因此需要尋找其它的一些方法。

    耶魯大學基因組與蛋白質(zhì)組研究中心的Mike Snyder在完成他的一篇發(fā)表在《美國國家*院刊》（PNAS）雜志上的文章（尋找擬南芥蛋白質(zhì)組中鈣調(diào)蛋白CaM和類鈣調(diào)蛋白CML（calmodulin-like）直接綁定蛋白，PNAS 104:4730-5, 2007）的時候找到了這樣一種方法：蛋白芯片方法。

    在這篇文章中，Snyder教授等人表達了1133個植物蛋白，并將這些蛋白及拷貝放置于硝化纖維膜包被玻片上，進行蛋白芯片研究，然后利用7種熒光標記的CaM和CML蛋白作為探針，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了173個蛋白伴侶。

    Snyder的實驗室在蛋白芯片研究方法處于世界位置——曾于2001描繪了酵母蛋白質(zhì)組芯片。Snyder認為芯片實驗具有幾個優(yōu)點，首先由于是體外實驗，因此觀察到的相互作用都是直接作用的，有中間介導的是不會出現(xiàn)的；第二，芯片能進行結(jié)合強度的直接比較，將相互作用強弱進行排行——這是其它方法獲得的數(shù)據(jù)無法比較的；zui后由于芯片上所有蛋白都是相同的數(shù)量，因此可以檢測到拷貝數(shù)非常低的蛋白相互作用。

    但另一方面，也正是由于芯片探針是體外進行的反應，因此結(jié)果需要在體內(nèi)進行驗證，而且芯片實驗可能對于一些研究人員來說確實比較貴和操作上比較繁瑣。

    目前商業(yè)性的蛋白芯片產(chǎn)品比較少，Snyder實驗室將他們的*給了Invitrogen，由此Invitrogen創(chuàng)造出了Protoarray系列產(chǎn)品。其中Yeast ProtoArray™ PPI （Protein-Protein Interactions） microarray就是一種在蛋白組水平上闡明蛋白之間的相互作用的高密度蛋白微陣列。

    相比較與Y2H，ProtoArray不需要花費數(shù)周時間，由于所有的酵母蛋白固定在玻片上，因此可以在一次實驗，短至4小時內(nèi)針對酵母蛋白組篩選標記的目的蛋白，以闡述針對超過4000種蛋白的蛋白相互作用，基本過程包括：封閉（1小時），加入*標記的探針；洗滌（10分鐘），加入Alexa Fluor® 647耦聯(lián)的鏈霉親和素檢測（30分鐘）；洗滌、干燥和掃描（1小時）。

    ProtoArray的一個重要就是確保對相互作用的zui大搜索，我們都知道，保持芯片蛋白處于有相互作用功能的狀態(tài)是利用這種方法研究蛋白相互作用的重要前提，但是要所有蛋白都保證這一點是不可能的。為了能盡可能達到這個要求，ProtoArray在芯片波片上包被上了硝化纖維，而已知硝化纖維與種類廣泛的蛋白功能相兼容，這一點Invitrogen的技術人員進行了確認.

    而且ProtoArray可以在不同條件下分析蛋白相互作用，闡述動態(tài)的相互作用，比如使用不同蛋白修飾狀態(tài)如磷酸化或者糖基化，不同的蛋白濃度，或者改變反應條件如離子強度，pH值或者溫度，添加輔助因子（cofactor）如二價陽離子，這些不僅可以幫助檢測出各種蛋白相互作用，而且可以更加地了解正在研究的相互作用的生物化學原理。

    另外，正如上文提及的，ProtoArray是以Snyder實驗室來源于酵母收集庫的優(yōu)良蛋白基礎上建立的，這個收集庫是由克隆到5’GST融合的酵母表達載體的開放閱讀框，通過融合GST標簽，蛋白可以很容易地在天然狀態(tài)下，以高通量的方式快速純化，可以收集到更多功能蛋白。