副豬嗜血桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒使用步驟：

一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。

2. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

8. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 上步制備的 PCR 陽性對照的第 4號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝）或第 5 號（濃度為 1×10E5拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 10 萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈送 15 次一管式病毒 DNAout

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于 PCR 陽性對照。如果做 2-3 次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加 2 或 3 倍。

11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）