人瘦素ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)原理：
瘦素酶免實(shí)驗(yàn)是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合瘦素分子上*抗原位點(diǎn)的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性瘦素的病人樣本在包被孔中與特異性兔抗瘦素抗體進(jìn)行孵育，之后就會(huì)形成一個(gè)夾心復(fù)合物。孵育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的物質(zhì)，再加入過氧化物酶標(biāo)記的抗兔抗體以檢測結(jié)合在包被板上的瘦素的量。加入底物溶液后，顯出的顏色強(qiáng)度與病人樣品中瘦素的濃度成正比。
試劑盒成分：
1）       包被板，12×8孔，可拆，微孔中包被了抗瘦素抗體（單克隆）
2）       標(biāo)準(zhǔn)品（0-5），6支 凍干型0.5mL，濃度：0,2,5,25,50,100ng/ml，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑
3）       質(zhì)控品， 2支，200ul，即用，2個(gè)濃度（低與高），具體數(shù)值與范圍請(qǐng)見試劑瓶標(biāo)簽或QC質(zhì)控單。內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑。
4）       實(shí)驗(yàn)緩沖液，1支，11ml，即用，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑
5）       抗血清，1支，11ml，即用，單克隆瘦素抗血清，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑。
6）       酶復(fù)合物，1支，11ml ，即用，辣根過氧酶標(biāo)記的抗兔復(fù)合物，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑
7）       TMB底物液，1支，14ml，即用
8）       終止液，1支，14ml，即用，內(nèi)含0.5M的H2SO4，避免接觸終止液，以免刺激皮膚或灼燒皮膚。
9）       洗滌液（40×），1支 30ml
注：零標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)視需要而定。
人瘦素ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟：
所有的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品都必須做雙份檢測以確保所有的檢測條件都一樣。每一次實(shí)驗(yàn)都有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1）將所需數(shù)目的板條置于板架上。。
2）用一次性吸嘴將標(biāo)準(zhǔn)品﹑質(zhì)控品和樣品分別15μL加入相應(yīng)的檢測孔中。
3）每孔加入100μL的檢測緩沖液。
4）充分混合10秒，在此步驟中充分混合非常重要。
5）室溫下溫育120分鐘。
6）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物，每孔用300μL洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。注意：洗板步驟是否正確操作會(huì)明顯影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度和度。
7）每孔加入100μL抗血清。
8）在室溫下溫育30分鐘。
9）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物，每孔用300μL的洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。
10）每孔加入100μL酶聯(lián)物。
11）在室溫下溫育30分鐘。
12）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物，每孔用300μL的洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。
13）每孔加入100μL底物液。
14）室溫溫育15分鐘。
15）每孔加入50μL終止液以終止酶反應(yīng)。
16）在加終止液后10分鐘內(nèi)于450±10nm處讀取OD值。
結(jié)果計(jì)算
1）計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值。
2）用吸光度值作為縱坐標(biāo)（y），濃度值作為橫坐標(biāo)（x），以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值對(duì)其相應(yīng)的濃度值進(jìn)行標(biāo)繪，作一標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3）用每一樣品的平均吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定其相應(yīng)的濃度。
4）自動(dòng)計(jì)算方法：在IFU上，它用四參數(shù)曲線已自動(dòng)計(jì)算出結(jié)果。其它的歸納方法可能會(huì)得出稍微不同的結(jié)果。
5）人瘦素ELISA試劑盒樣品的濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取。樣品中HPL濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的必須用進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。在計(jì)算樣品濃度時(shí)就應(yīng)當(dāng)把此稀釋因子考慮進(jìn)去。