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簡(jiǎn)介
蛋白質(zhì)的抽提是指破碎過(guò)程中，將生物材料在水，緩沖液或稀鹽溶液等適當(dāng)溶劑中浸泡，使胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等內(nèi)容物釋放到溶劑中。
與細(xì)胞總蛋白的提取實(shí)驗(yàn)相似的是動(dòng)物組織的總蛋白提取，它需要?jiǎng)驖{機(jī)或者研磨棒將組織塊分散，再加入裂解液并提取蛋白質(zhì)。
原理
細(xì)胞蛋白的提取是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中一種常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)方法，是很多其他生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的前提。通過(guò)加入裂解緩沖溶液以及相應(yīng)的蛋白酶抑制劑，能較好的保持細(xì)胞內(nèi)生物大分子的天然狀態(tài)，在透膜劑以及超聲破碎儀的輔助下，細(xì)胞將發(fā)生破裂，內(nèi)容物釋放出來(lái)。
用途
1. 蛋白免疫印跡；
2. 蛋白免疫沉淀；
3. 核漿分離等制備型和分析型實(shí)驗(yàn)。
材料與儀器
細(xì)胞、細(xì)胞刮、裂解液、槍頭、燒杯、超聲破碎儀，離心機(jī)，EP 管，制冰機(jī)，記號(hào)筆。
步驟
一、蛋白提取
1. 從培養(yǎng)箱中取出待提取的細(xì)胞，用吸引器洗掉培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)皿置于冰上；
2. 往培養(yǎng)皿中加入適量的裂解液，并加入相應(yīng)量的蛋白酶抑制劑，一般來(lái)說(shuō)，12 孔板加入100 μL 裂解液，6 cm 皿加入 300-400 μL 裂解液，晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使得裂解液流過(guò)細(xì)胞表面；
3. 在冰上用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮離培養(yǎng)皿，并收集到 1.5 mL EP 管中；
4. 在冰上超聲破碎細(xì)胞（根據(jù)儀器的功率調(diào)節(jié)），一般超聲 10-15 下即可；
5. 超聲好的細(xì)胞放入離心機(jī)中，12000 g，4℃，離心 15 分鐘；
6. 離心完后，取出 EP，小心的將上清液轉(zhuǎn)移至一干凈的 EP 管中，待用。
二、蛋白濃度的測(cè)定
1. 取 96 孔板，5 孔，每孔加入 10 μL 0.9% NaCl，最后一孔加入 10 μL 2 mg/ml 的 BSA 溶液，在倒數(shù)第二孔加入 10 μL BSA，用移液槍吹打混勻之后，吸出 10 μL 至倒數(shù)第三孔中，同樣操作一直至第二孔混勻后，棄 10 μL 溶液，此為標(biāo)準(zhǔn)曲線孔；
2. 另取孔，每孔 8 μL 0.9% NaCl 溶液，再加入 2 μL 提好的蛋白溶液；
3. 按照蛋白濃度測(cè)定試劑盒的說(shuō)明配制好測(cè)定液，在上述濃度測(cè)定孔中每孔加入 200 μL 混合液，將平板放入 37℃ 生化箱中孵育 15-20 分鐘，再用酶標(biāo)儀測(cè)定，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算每個(gè)蛋白樣品的濃度；
4. 提取好的蛋白上清液加入等量的 2 x loading buffer，并在沸水中煮沸 15 分鐘；
5. 一般細(xì)胞樣品按照 30 μg 的總上樣量計(jì)算出相應(yīng)的上樣體積，記錄備用，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)
1. 有些蛋白容易降解，所以樣品需要一直放在冰上，樣品用完后短期負(fù)二十冰箱保存；
2. 勤換槍頭，避免交叉污染；
3. 超聲的次數(shù)和功率不能劇烈，容易使得蛋白斷裂；
4. 檢測(cè)磷酸化蛋白，盡量添加磷酸酶抑制劑；
5. 由于某些蛋白的特性，樣品不需要煮沸。
常見(jiàn)問(wèn)題
1. 蛋白拖尾？
可能是超聲太過(guò)劇烈，并且超聲太過(guò)劇烈，對(duì)于一些小體積的樣本，非常容易造成樣品飛濺，損失樣品。
2. 蛋白濃度太低？上樣量太大？
應(yīng)按照個(gè)人經(jīng)驗(yàn)和不同細(xì)胞的特性，適當(dāng)?shù)恼{(diào)整裂解液加入的體積，并且在最后可以加入 5 x loading buffer 來(lái)變性樣品。
