過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標記常用此法。反應時，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基形成Schiff氏堿而結合。酶標記物按克分子比例聯結，其比例為：酶/抗體=1-2/1。此法簡便有效，一般認為是HRPzui可取的標記方法，但也有人認為所有試劑較為強烈，各批實驗結果不易重演。 按以上方法制備的酶結合物一般都混有未結合物的酶和。理論上，結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中zui后的酶活性測定，因經過*洗滌，游離酶可被除去，并不影響zui終的顯色。ELISA試劑盒但游離的抗體則不同，它會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，從而減少了結合到固相上的酶標抗體的量。
ELISA試劑盒中常用的酶一般都用此法交聯。它具有操作簡便、有效（結合率達60%-70%）和重復性好等優點。缺點是交聯反應是隨機的，酶與抗體交聯時分子間的比例不嚴格，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯，影響效果。諏講椒ㄖ校?br> 先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標抗體。ELISA試劑盒也可先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯結。兩步法的產物中絕大部分的酶與蛋白質是以1:1的比例結合的，較一步法的酶結合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯的有效率較一步法低。
