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上海研生生化試劑有限公司

寡核苷酸與抗體的結合

時間:2015-7-1閱讀:521
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寡核苷酸與抗體的結合
連接用的抗體可以是特異性一抗,也可以是第二抗體或其他的連接二抗,如抗(Dig)、抗熒光素(FITC)或抗*(biotin)二抗。

1.抗體的脫鹽和活化
首先對抗體免疫球蛋白進行脫鹽,然后進行抗體活化。在41 nmol抗體分子中加入410mmol的GMBS[硫代—N—(4—馬來酰亞胺丁酰)硫代丁二酰亞胺,sulfo-N-(4—maleim—idobutyryloxy)sulfosuccinimide],暗處,37℃,在氮氣中30 rain,移人室溫中繼續反應30min,用PD-10色譜柱(用pH7.5 PBS平衡柱子)除去多余的磺化—GMBS,將活化抗體4℃濃縮。此時每一個抗體分子中含有多個馬來酰亞胺,可以用Ellman’s試劑滴定活化抗體的量,主要測定抗體分子上的巰基。抗體活化后與寡核苷酸連接。

2.活化抗體與寡核苷酸結合
將28.1nmol磺化GMBS活化抗體和142 nmol5硫醇寡核苷酸混合,總體積為825ul,室溫中反應2h,隨后移人4℃中反應過夜。

3.純化結合物
純化結合物一般先用陰離子交換色譜柱Q—sepharose(先用梯度鹽洗柱,然后加樣,洗脫,收集結合物),再用SephadexG-200色譜柱除去游離的寡核苷酸。純化后結合物中寡核苷酸和抗體之比為10:1,多數情況下,1個抗體分子可結合3~5個寡核苷酸。

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