一、同位素法

    51 Cr釋放法(以CTL為例)51Cr釋放法是用鉻酸鈉(Na51CrO4)標(biāo)記的靶細(xì)胞與致敏淋巴細(xì)胞一起培養(yǎng)，靶細(xì)胞被CTL殺滅后，51 Cr即釋放到培養(yǎng)液中，測定釋放到培養(yǎng)液中51 Cr的脈沖數(shù)(cpm)即反映出CTL殺靶細(xì)胞的程度。

(一)材料

1．新鮮的外周(肝素)抗凝血液。

2．靶細(xì)胞(通常選用傳代的腫瘤細(xì)胞如K562)。

3．RPMI 1640培養(yǎng)液、PBS緩沖液。

4．閃爍計數(shù)器。

(二)方法

1．短期標(biāo)記法

(1)用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌107個靶細(xì)胞，去上清液。用O．5ml不含*的*培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。加入100μCi(3．7MBq)51Cr鉻酸鈉，37℃水浴中標(biāo)記1h，每5～lOmin搖晃一次，混勻細(xì)胞。

(2)如上用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，每次1000 r／min離心10min。用50mlRPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，置37℃水浴30min，以減少非特異的自然釋放。

(3)1000r／min離心10min，去上清液。小心用RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，盡量減少振蕩引起的細(xì)胞損傷以降低靶細(xì)胞的自然釋放率，將細(xì)胞濃度調(diào)整為O．5×105／ml或l×105/ml備用。

2．51Cr釋放實驗

(1)在96孔l圓底細(xì)胞培養(yǎng)板中加入51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞，每孔加100μl。

(2)向各孔加100μl效應(yīng)細(xì)胞(利用淋巴細(xì)胞分離液分離得到的淋巴細(xì)胞)，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例(E：T)根據(jù)要求而定，通常為5：l～20：l。陰性對照孔(自然釋放)不加效應(yīng)細(xì)胞只加100／~1*培養(yǎng)液，陽性對照7L(zui大釋放)中加lOOμl1％NP40(或2%SDS，1mol／L鹽酸)。每個實驗置3個復(fù)孔。

(3)1000r／min離心，3min后，置37℃5％C02的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。

(4)離心培養(yǎng)板1500r／min 10min，每孔吸出100μl上清液置一次性使用的檢測管中，在γ計數(shù)儀上(或液閃計數(shù)儀上)測定上清液中的每分鐘放射性活性(cpm值)。

(三)結(jié)果分析

    特異性殺傷活性的計算。

1．用細(xì)胞毒性百分比表示

    一般自然釋放率>15％，對照釋放率<5％，而特異性釋放率>10％才有意義。

2．用溶解單位(Lu)表示一個Lu是指能溶解一定數(shù)量靶細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)。通常將能溶解30％靶細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)定為一個Lu。結(jié)果以l06個效應(yīng)細(xì)胞所具有的Lu數(shù)表示：Lu30／106細(xì)胞=106／[(E：T30)×(每孔靶細(xì)胞數(shù))]，E：T30是該效靶比時效應(yīng)細(xì)胞能殺傷30％靶細(xì)胞。