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技術文章

流式細胞凋亡實驗步驟

閱讀：241發布時間：2016-3-16

一、收集細胞
 
收集細胞｛數目約（1~ 5）×106個/mL｝，500~ 1 000 r/min離心5 min，棄去培養液。
 
二、細胞洗滌
 
3 ml PBS洗滌1次。
 
三、乙醇固定
 
離心去PBS，加入冰預冷的70%的乙醇固定，4℃，1-2小時。
 
四、細胞重懸
 
離心棄去固定液，3 mlPBS重懸5 min。
 
五、細胞過濾
 
400目的篩網過濾1次，500-1000 r/min離心5 min，棄去PBS。
 
六、染色
 
用1 ml PI染液染色，4℃避光30 min。
 
七、流式細胞儀檢測
 
PI用氬離子激發熒光，激光光波波長為488 nm，發射光波波長大于630 nm，產生紅色熒光分析PI熒光強度的直方圖也可分析前散射光對側散射光的散點圖。
 
八、結果判斷
 
在前散射光對側散射光的散點圖或地形圖上，凋亡細胞與正常細胞相比，前散射光降低，而側散射光可高可低，與細胞的類型有關；在分析PI熒光的直方圖時，先用門技術排除成雙或聚集的細胞以及發微弱熒光的細胞碎片，在PI熒光的直方圖上，凋亡細胞在G1/G0期前出現一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在位置的熒光強度為1.0，則一個典型的凋亡細胞樣本其亞二倍體峰的熒光強度為0.45，可用雞和鮭魚的紅細胞的PI熒光強度做參照標準，兩者分別為0.35和0.7，可以確保在兩者之間的不是細胞碎片而是完整的細胞。


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