蛋白質含量的測定→Folin酚法
目的要求
學習Folin-酚法測定蛋白質含量的原理和方法。
實驗原理
Folin-酚試劑法zui早是由Lowry確定的測定蛋白質濃度的基本方法。以后在生物化學領域得到廣泛的應用。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin-酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這個方法的優點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時較長，要嚴格控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。凡干擾雙縮脲反應的基團，如—CO—NH2，—CH2—NH2，CS—NH2以及Tris緩沖液、蔗糖、硫酸銨、疏基化合物均可干擾Folin-酚反應，而且對后者的影響還要大得多。此外，酚類、檸檬酸對此反應也有干擾作用。
Folin-酚試劑由甲試劑和乙試劑組成。甲試劑由碳酸鈉，氫氧化鈉，硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。蛋白質中的肽鍵在堿性條件下，與酒石酸鉀鈉銅鹽溶液起作用，生成紫紅色配位化合物。乙試劑是由鱗鉬酸和麟鎢酸、硫酸、溴等組成。此試劑在堿性條件下，易被蛋白質中*的酚基還原呈藍色反應，其色澤深淺與蛋白質含量成正比。此法也適用于測定*和*的含量。
本法可測定范圍是25～250ug蛋白質。
試劑和器材
- 試劑
（1）、Folin-酚試劑甲：
A·4%碳酸鈉溶液；
B·0.2mol/L氫氧化鈉溶液；
C·1%硫酸銅溶液；
D·2%酒石酸鉀鈉溶液。
臨用前將a與b等體積配制碳酸鈉-氫氧化鈉溶液。c與d等體積配制成硫酸銅-酒石酸鉀鈉溶液，然后這兩種試劑按50:1的比例配合，即成Folin-酚試劑甲。此試劑臨用前配制，一天內有效。
（2）、Folin-酚試劑乙。稱鎢酸鈉（Na2WO2·2H2O）100g鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）25g置2000mL磨口回流裝置內，加蒸餾水700mL，85%磷酸50mL和濃硫酸100mL。充分混勻，使其溶解。小火加熱，回流10h（燒瓶內加小玻璃珠數顆，以防溶液溢出），再加入硫酸鋰（LiSO4）150g，蒸餾水50mL及液溴數滴。在通風櫥中開口煮沸15min，以出去多余的溴。冷卻后定容至1000mL，過濾即成Folin-酚試劑乙貯存液，此液應為鮮黃色，不帶任何綠色。置棕色瓶中，可在冰箱長期保存。若此貯存液使用過久，顏色由黃變綠，可加幾滴液溴，煮沸幾分鐘，恢復原色仍可繼續使用。
試劑乙貯存液在使用前應確定其酸度。乙之滴定標準氫氧化鈉溶液（1mol/L左右），以*為指示劑，當溶液顏色由紅→紫紅→紫灰→墨綠時即為滴定終點。該試劑的酸度應為2mol/L左右，將之稀釋至相當于1mol/L酸度應用。
2、標準和待測蛋白質溶液
（1）、標準蛋白質溶液。結晶牛血清白蛋白或酪蛋白，預先經微量克氏定氮法測定蛋白質含量，根據其純度配制成150ug/mL蛋白溶液。
（2）、待測蛋白質溶液。人血清，使用前稀釋150倍。
3、器材
試管1.5cm×15cm（×6），試管架，移液管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；恒溫水??；分光光度計。
注意事項
(1)、Folin-酚乙試劑在酸性條件下較穩定，而Folin-酚甲試劑是在堿性條件下與蛋白質作用生成堿性的銅-蛋白質溶液。當Folin-酚乙試劑加入后，應迅速搖勻（加一管搖一管），使還原反應產生在麟鉬酸-麟鎢酸試劑被破壞之前。
（2）、血清稀釋的倍數應使蛋白質含量在標準曲線范圍之內，若超過此范圍則需將血清酌情稀釋。
